真空冷冻干燥乳酸菌的研究进展

黄 刚，金 刚

（1.宁夏大学 农学院，宁夏银川 750021；2.宁夏大学 食品与葡萄酒学院，宁夏银川 750021）

乳酸菌经过增殖培养、浓缩分离后，与适量的保护剂进行混合制成菌悬液，再经干燥处理可制成乳酸菌发酵剂。目前，常用的干燥方法有烘干、喷雾干燥、真空冷冻干燥等。其中，真空冷冻干燥是目前对菌体保藏效果最好、保藏时间最长的一种乳酸菌发酵剂制备技术，该技术可以保持菌体的生理生化特性和生物活性。然而，真空冷冻干燥过程中也会导致乳酸菌活力下降甚至死亡。国内外学者针对有关乳酸菌在真空冷冻干燥过程中的损伤机制做了大量研究，发现乳酸菌在真空冷冻干燥后造成菌体存活率以及发酵活力降低的主要原因包括冷冻干燥过程造成细胞膜通透性改变、细胞完整性被破坏、细胞酶及相关蛋白变性和核糖核酸结构发生变化等[1]。

为了进一步提高乳酸菌在真空冷冻干燥后的存活率和储藏期，本文对真空冷冻干燥原理以及影响乳酸菌冻干存活率的关键因素进行了讨论，以期为制备高活性和耐储藏的乳酸菌发酵剂提供参考。

1 乳酸菌发酵剂概况

随着科学技术的不断发展，1988 年丹麦汉森中心实验室成功研制了直投式乳酸菌发酵剂，在此之前液体发酵剂使用了数十年。与液体发酵剂相比，直投式乳酸菌发酵剂具有活菌数高（109～1012CFU/g）、保质期长、接种量少和产品质量稳定等特点，且不需要进行活化、扩培等处理，可直接应用于生产，大大提高了劳动生产力与产品质量。

目前，我国对真空冷冻干燥的工艺应用日渐成熟，但是由于菌种间的差异以及所使用冻干机的不同，还没有一种通用的冻干方法来适应于所有菌种。

2 真空冷冻干燥原理

乳酸菌菌液中水分是以自由水和结合水两种方式存在，结合水以化学结合方式存在于菌液中。真空冷冻干燥采用了低温低压下的热传导机理，当压强低于610.5 Pa 时，不管温度如何变化，只有固态和气态，所以在此条件下升高温度或者降低压强都可以打破两相平衡，使整个系统朝着冰转换成水蒸气的方向发展，即将菌液中的固态冰直接转换为水蒸气的干燥过程。

整个真空冷冻干燥过程主要分3 个阶段完成，预冻→升华干燥（一次干燥）→解析干燥（二次干燥）[2]。

3 真空冷冻干燥对菌体造成的损伤

真空冷冻干燥主要分为冷冻和干燥两个过程，冷冻对菌体造成的伤害主要表现为细胞的渗透失水和冰晶的形成，干燥对菌体的伤害主要表现在细胞的过度失水。在真空冷冻干燥过程中对乳酸菌的细胞损伤主要表现在以下几个方面。

3.1 机械损伤

在真空冷冻干燥过程中，由于快速降温，细胞内外形成结晶，产生机械力，从而导致细胞出现机械损伤。一般结晶形成的冰晶越大，细胞膜越容易破裂，从而造成细胞的死亡；冰晶越小对细胞的损伤也就越小。通常认为降温速率的大小影响着冰晶的大小，从而影响着细胞是否会受到损伤。许多研究者认为，细胞内结晶是在快速降温时产生细胞损伤的主要原因[3]。

3.2 溶质损伤

在真空冷冻干燥过程中，由于细胞内所含水分的冻结使细胞间隙间的溶液逐渐浓缩，从而使电解质的浓度显著增加。细胞内外由于渗透压的存在导致细胞脱水，细胞内的蛋白质对高浓度的电解质极为敏感，容易造成蛋白质的变性，进而使其丧失应有的功能，增加了细胞的死亡率。

3.3 细胞膜损伤

细胞膜的损伤被认为是菌体在真空冷冻干燥过程中失活的主要表现，另有研究表明细胞膜的损伤主要发生在干燥阶段[4]。微生物的干燥损伤很大程度上是由于膜脂性质、结构的变化使膜的流动性或完整性改变，导致细胞膜的功能失调，从而影响微生物的生命活动。

3.4 胞内酶失活

乳酸菌在真空冷冻干燥过程中，一些细胞内的关键酶会发生结构和功能的改变，从而使整个细胞代谢紊乱，导致细胞的死亡。例如，乳酸脱氢酶、三磷酸腺苷酶、β-半乳糖苷酶在真空冷冻干燥时会发生结构与功能的改变[5]。

3.5 DNA 损伤

DNA 损伤也是冻干过程中造成菌体损伤的主要原因之一。有学者在真空冷冻干燥瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）时发现了DNA 和RNA 的改变。DNA 一旦产生损伤，在其修复过程中就会容易产生错误，导致突变体的增加[6]。

4 影响乳酸菌冷冻干燥存活率的因素

4.1 菌体的收集时期

在乳酸菌生长过程中，培养基的环境会发生改变，如pH 降低、代谢物的产生、营养物质的消耗等，为了获得更高的活菌数，必须及时将菌体从培养基中离心收集，从生理状态上来讲有利于提高冻干后菌体的存活率和初始菌体的活菌数，而收集过程中直接影响菌体活性的则是菌体的菌龄。ZHANG 等[7]对酒类酒球菌（Oenococcus oeni）SD-2a 冷冻干燥后发现，在稳定期早期收集菌体比对数中期的存活率更高。

4.2 乳酸菌的应激反应

李宝坤[8]在罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri）CICC6226 真空冷冻干燥过程中发现，经过冷应激和热应激都提高了L. reuteriCICC6226 冻干后的存活率。以上研究表明，在真空冷冻干燥前对乳酸菌进行一定的应激处理可以提高乳酸菌在冻干后的存活率和耐储存性，例如冷应激、热应激、酸应激，这些应激反应可以使细胞对不利条件提前做出反应，产生应激蛋白、改变细胞膜脂肪酸的组成以及相容溶质的转运或合成，从而提高乳酸菌对不利条件的抵抗力[9]。

4.3 冻干保护剂及其保护机理

在真空冷冻干燥过程中，难以避免乳酸菌的损伤，可以通过外源添加保护剂的方式来提高乳酸菌冻干后的存活率和储藏时间[10]。乳酸菌的冻干保护剂按照能否进入细胞可以分为渗透型和非渗透型两类。渗透型保护剂因为能够进入细胞与溶液中的水分子结合，从而发生水合作用，使细胞黏稠性增加，在冻干过程中温度降低，溶液中冰晶的形成速率因此减慢，一定程度上降低了水转换为冰晶的比例，从而减少了细胞外溶质浓度升高所造成的细胞损伤；非渗透型保护剂不能透过细胞膜，常常包裹在细胞表面，降低了溶液形成冰晶的速率，在特定的温度下可以降低细胞外溶质的浓度，从而避免了在冻干过程中由于盐类浓缩，使细胞失水而导致的菌体渗透性休克、细胞膜和细胞壁的塌陷、蛋白质变性等不良问题。

4.4 冻干后乳酸菌含水量对其存活率及储藏期的影响

脱水程度的增加会造成乳酸菌蛋白质损伤和存活率下降，所以应该保留一部分水分来维持细胞的休眠状态。目前有研究表明，乳酸菌冷冻干燥过程中，残余的水分质量在2%～3%对于维持细胞结构和胞内大分子稳定性是必要的，菌体的相对存活率较高、储藏期较长[11]。

5 讨论与展望

影响乳酸菌真空冷冻干燥后存活率的因素是多方面的。①菌种的自身因素，因种、属的差异而不同，如链球菌属抗冷冻干燥能力较强，而明串菌属对冷冻干燥的抵抗力较差；嗜冷微生物要比嗜热微生物更加抗冻。②合理的冻干程序设定也非常重要，在真空冷冻干燥过程中存在两个最大冰晶的生成带，即-3.7 ～0 ℃和-37.4 ～-30.0 ℃，快速通过冰晶生成带可以减少菌体的冷冻损伤[12]。为了提高乳酸菌冻干后的存活率，常常使用保护剂，保护剂可以维持乳酸菌冻干后的生物活性和生理状态，通常复配使用效果更好。

综上分析，要提高乳酸菌的冻干存活率和储藏期，需要从两个方面进行深入研究：①根据菌种特性以及真空冷冻干燥损伤机制设置合理的冻干程序；②筛选高效合理的冻干保护剂和复水溶剂，既要保证菌体的存活率和活性，也要降低成本。