人参皂苷Rg3抗肝癌作用研究进展

唐琳琳 李洪英 刘文山 丁传华

潍坊医学院附属医院药学部，潍坊 261031

2018年GLOBOCAN 数据显示，全球肝癌发病率位居恶性肿瘤第6 位，病死率位居恶性肿瘤第2 位［1］。中晚期肝癌患者中位生存期短，对化疗药物耐药性高，推荐中医中药辅助肝癌的治疗［2］。人参皂苷Rg3（Ginsenoside Rg3，GRg3）是从五加科植物人参、西洋参、三七等根茎、茎叶提取的天然产物［3］，具有抗肿瘤、逆转肿瘤靶向药物耐药等活性，对常见恶性肿瘤肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌均有抑制作用［4］。2003年以GRg3单体为主要成分的抗癌新药参一胶囊上市，应用于肺癌、肝癌的辅助治疗。本文主要阐述GRg3治疗肝癌的临床前及临床研究进展，以期对后续研究提供参考。

GRg3的来源

1983年日本学者从朝鲜红参中第1 次分离得到GRg3，它是一种四环三萜达玛烷型稀有人参皂苷，在人参、西洋参、三七根和根茎中含量较少，在陈年参、人参茎叶、炮制的红参及黑参中含量较高。按化学结构分类属于原人参二醇型皂苷，结构式为C42H72O13，相对分子质量为784。天然人参皂苷Rb1、Rb2和Rd经过加热、酶解可转化为GRg3［5］。由于C20 位空间结构不同，GRg3 存在两种对映体，即20（S）和20（R）异构体。20（S）-Rg（3）和20（R）-Rg3 三级结构的差异，导致20（S）-Rg3 抗肿瘤活性优于20（R）-Rg3［6］。与20（R）-Rg3 相比，20（S）-Rg3 可明显抑制HepG2 细胞增殖及凋亡［7-8］。20（S）-Rg3苷元部分的烯烃链在C20附近产生紧密的疏水堆积，促进了其与Ca2+、Na+离子通道和几种配体门控离子通道间的氢键结合，使其与离子通道受体区相互作用更强［9］。

GRg3抗肝癌作用研究

1、GRg3抗肝癌作用临床前研究

1.1、体外实验 体外实验显示，GRg3 可抑制多种肝癌细胞的生长，包括Hep3B、SMMC-7721、HepG2、Bel-7402、HCCLM3、SK-Hep1、SMC-7721、MHCC-97 细胞，抑制作用呈浓度依赖性和剂量依赖性［10-17］。

1.2、体内实验 体内研究显示GRg3 能显著抑制肝癌细胞荷瘤小鼠肿瘤的生长［12-14］。Sun等［12］在体内实验证实，GRg3 可显著抑制HepG2 和MHCC-97L 在BABL∕c 裸鼠体内的生长。将肝癌细胞Hep1-6 植入小鼠肝脏构建原位肝癌模型。口服GRg3（10 mg·kg-1·d-1，连续30 d）显著降低原位肝癌的生长，提高荷瘤小鼠的存活率和存活时间［13］。另一项体内实验显示，20（R）-Rg3 比20（S）-Rg3 对H22 移植瘤生长的抑制率更显著，抑制率分别为40.9%和23.6%。GRg3 可通过刺激小鼠淋巴细胞增殖及升高白细胞介素-2 和干扰素-γ 水平显著增强H22 荷瘤小鼠的细胞免疫功能［14］。

GRg3 增敏化疗药物抗癌效果。肝癌中位生存期较短，对化疗药物耐药性高。研究表明，GRg3、奥沙利铂单药或两药联合均能有效抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖，促进其凋亡，两药联合组效果比单药组更显著［15］。体外实验显示GRg3 通过抑制自噬通量增敏阿霉素诱导的肝癌细胞死亡。体内实验，证实GRg3 与阿霉素联合用药可显著抑制Huh-7 细胞移植裸鼠肿瘤体积［16］。Jiang 等［17］研究发现，GRg3 以剂量和时间依赖性方式抑制肝癌细胞Hep1-6 和HepG2 的活力。用荷瘤C57BL∕6 小鼠做生存实验，与对照组比较，GRg3、环磷酰胺、GRg3+环磷酰胺实验组肿瘤生长速度延迟，明显延长荷瘤小鼠的生存时间。肿瘤HE染色显示，对照组肿瘤呈浸润生长，血流丰富，实验组肝细胞染色质固缩、凝集，失去血供。

1.3、GRg3联合肝动脉栓塞技术可显著改善疗效 经动脉栓塞术（transcatheter arterial embolization，TAE）是一种用栓塞剂堵塞肝肿瘤供血动脉的微创技术［18］。肝细胞癌经TAE 治疗可阻断肝癌动脉血供，促进肝癌组织的坏死、缺氧，进而诱导肝癌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）上调和血管生成增加［19］。构建肝细胞癌大鼠原位移植模型，分为对照组、GRg3、TAE 组、GRg3+TAE 组。GRg3+TAE 组治疗8周后，肿瘤长径明显短于对照组。GRg3+TAE 组和GRg3 组肝内和腹腔转移率明显低于对照组。GRg3+TAE 组总生存率优于TAE 组，微血管密度显著低于TAE 组。GRg3+TAE 组VEGF 和VEGF 受体表达明显减少，GRg3+TAE 治疗通过下调VEGF 的表达抑制肝癌远处转移，延长大鼠生存期［20］。

一项研究观察TAE 联合肝动脉给药GRg3 治疗兔VX2肝肿瘤效果。结果显示，肝动脉给药增加GRg3局部浓度，TAE 联合GRg3组平均肿瘤体积和生长速率明显低于对照组。GRg3 可抑制肿瘤缺血缺氧引起的血管生成活性，诱导VX2 肝肿瘤细胞凋亡，是一种安全有效的治疗兔VX2 肝肿瘤的方法［21］。

1.4、GRg3特殊制剂抗肝癌作用研究 GRg3在水中溶解度小，生物利用度低，限制了其在临床的应用。为改善GRg3溶解度，增加抗肿瘤活性，针对GRg3的特殊制剂研究越来越多，如纳米制剂、脂质体等［22-24］。制备GRg3-mPEG-PLLA（甲氧基聚乙二醇-聚乳酸，mPEG-PLLA）共聚物载药胶束，体内外实验表明，该载药胶束可显著抑制肝癌HepG2 细胞生长及肝癌异种移植裸鼠肿瘤体积增加，提高了GRg3的溶解度及生物活性［25］。GRg3 与Fe@Fe3O4纳米颗粒偶联制备纳米药物，与GRg3相比，纳米GRg3可显著延长原位肝癌小鼠的生存时间，明显减少肝脏表面肿瘤数量和肿瘤长径、减少肝癌的肺转移［22］。采用薄膜分散法制备Rg3 脂质体，包封率为82.47%。与GRg3 溶液相比，GRg3 脂质体组的峰值浓度（Cmax）和曲线下面积（AUC）分别增加1.19 倍和1.52 倍。GRg3 脂质体组对HepG2 细胞的细胞毒性和抑制率明显高于GRg3组［24］。

2、GRg3（参一胶囊）抗肝癌的临床研究

一项前瞻性临床试验，观察肝癌合并门静脉癌栓患者手术后，分别给予GRg3（一次20 mg，2 次∕d）、索拉非尼（每次400 mg，2 次∕d）口服，对远期生存时间、术后肿瘤复发时间的影响。GRg3 组共31 人，索拉菲尼组共33 人，术后无瘤中位生存时间分别为8 个月和9 个月，差异无统计学意义；术后中位生存时间12 个月和14 个月，差异有统计学意义。GRg3 远期抗肿瘤作用弱于索拉菲尼，建议肝癌合并门静脉癌栓手术后服用索拉菲尼，经济条件限制的患者建议口服GRg3［26］。

一项比较GRg3 联合肝动脉化疗栓塞术（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）和单独TACE 治疗晚期肝癌的有效性和安全性临床试验。228 例晚期肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者被随机分配到两个治疗组。GRg3 联合TACE 组的中位总生存期为13.2 个月，TACE 组为10.1 个月，中位进展时间分别为4.3 个月比3.2 个月（P=0.151），不可治疗进展的中位时间分别为8.3 个月、7.3 个月（P=0.063）。GRg3 联合TACE 组肿瘤控制率为69.7%，TACE 组为51.3%（P=0.012）。GRg3 缓解了一些与TACE 相关的不良综合征和血液异常。在肝功能良好的晚期HCC 患者中，GRg3 联合TACE 较单独TACE 可延长患者的总生存期［27］。

GRg3抗肝癌的作用机制

1、诱导肝癌细胞凋亡

体内外研究表明，GRg3可诱导多种癌细胞凋亡［15，28-30］。Park等［10］研究发现GRg3明显抑制Hep3B细胞增殖，促进凋亡。GRg3 通过升高细胞内活性氧（ROS）的水平，激活Bax蛋白，下调Bcl-2 蛋白表达，降低了线粒体膜电位，刺激Hep3B细胞线粒体细胞色素c的释放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3 的激活，直接激活线粒体途径诱导细胞凋亡。针对肝癌细胞SMMC-7721和HepG2细胞系研究中［31］，GRg3 给药组的细胞增殖抑制率、凋亡率显著高于对照组，并且细胞增殖抑制率、凋亡率随着GRg3浓度和治疗时间的增加而增加。机制方面，GRg3 组与对照组相比，肝癌细胞促调亡基因Bax 和caspase-3 的表达水平显著增强，抗凋亡基因Bcl-2的表达水平显著抑制，推测也是通过线粒体途径诱导细胞凋亡。另一项研究发现，GRg3作用于HepG2细胞后观察到细胞凋亡和线粒体肿胀和裂解，剂量依赖性方式下 调Bcl-2 和 上 调Fas［8］。GRg3 通 过 影 响 凋 亡 相 关 基 因Bcl-2-caspase9-caspase3 和PI3K∕AKT∕mTOR 信号通路诱导骨肉瘤细胞凋亡［32］。Zhang 等［28］研究发现，20（S）-Rg3 使胆囊癌细胞线粒体膜电位明显降低，证明20（S）-Rg3 诱导胆囊癌细胞凋亡是通过线粒体途径来发挥作用的。钠氢交换蛋白-1（Na+∕H+exchanger1，NHE1）调节细胞间pH 值，在肝癌组织中呈现高表达，促进肝癌的恶化，抑制NHE1 可促进肝癌凋亡［33］。基于体内外研究，观察到GRg3可以通过降低NHE1 表达抑制肝癌细胞Bel-7402、HCCLM3 增殖，诱导细胞凋亡。同时发现表皮生长因子可以上调NHE1 的表达，而GRg3 正是通过抑制EGF-EGFR-ERK1∕2-HIF-1α 途径来降低NHE1的表达来诱导肝癌细胞凋亡［34］。

外源性凋亡途径又称为死亡受体途径，20（S）-Rg3 对外源性途径诱导的肝癌细胞调亡具有增敏作用。TRAIL 信号通路因对肿瘤细胞的选择毒性，成为抗癌药物研究的靶点，但耐药性限制了TRAIL 的研发。研究 表明，20（S）-Rg3 通过上调DR5 的表达来敏化TRAIL 诱导 的 肝 癌 细 胞 凋 亡，包 括HepG2、SK-Hep1、Huh-7 和Hep3B，但对正常肝细胞HL-7702 生长无抑制作用。在小鼠异种移植模型中，20（S）-Rg3 与TRAIL 联用可通过凋亡途径，显著抑制Huh-7 细胞荷瘤裸鼠肿瘤的生长，联合应用抑制TRAIL耐药［35］。

2、GRg3与自噬的关系

一项研究表明，GRg3 通过ATG5 依赖性自噬途径增加SK-Hep1 和HepG2 细胞LC3 II 蛋白水平。GRg3 抑制自噬晚期阶段，导致自噬通量阻滞。阿霉素诱导的自噬具有促肝癌细胞生存作用，可引起肝癌细胞耐药。体外研究发现，GRg3 与阿霉素联用，可抑制自噬，克服化疗耐药性，增敏阿霉素诱导的肝癌细胞死亡。用小鼠异种移植模型也证实了GRg3 与 阿 霉 素 的 协 同 作 用［16］。Bian 等［36］研 究 发 现20（S）-Rg3 抑制饥饿状态下的细胞自噬，使细胞无法通过自噬维持稳定状态，进而诱导凋亡。20（S）-GRg3阻断自噬晚期的溶酶体融合和自噬溶酶体降解，使自噬和凋亡之间失去平衡，导致细胞凋亡。另一项研究却发现20（S）-GRg 3 触发HepG2 细胞自噬，观察到自噬空泡及自噬溶酶体产生增加［8］。

3、GRg3抑制肝癌细胞侵袭转移、黏附

大量研究表明，GRg3 能显著抑制肝癌细胞侵袭、转移和黏附。作为Rho 信号负调控因子，Rho GTPase激活蛋白9（ARHGAP9）在肝癌中表达下调。研究表明，GRg3 能显著降低肝癌细胞HepG2 和MHCC-97L 的侵袭和迁移能力，抑制HepG2和MHCC-97L在BABL∕c裸鼠体内的生长。经GRg3 处理后，这两种肝癌细胞中ARHGAP9 蛋白表达增加。ARHGAP9 基因敲除后，GRg3 的抗肝癌细胞侵袭、迁移和抗肿瘤生长作用明显受损，GRg3 诱导的ARHGAP9 蛋白表达增加明显受到抑制。结果提示ARHGAP9 蛋白可能是GRg3 抗侵袭转移作用的重要调节 因 子［12］。Mao 等［37］发现GRg3 能通过下调基质金属蛋白酶（MMP）2∕MMP7∕MMP9、抑制上皮间质转化（EMT）以及Wnt∕β-catenin 蛋白表达抑制癌细胞的迁移和侵袭。Liu 等［38］研究发现，20（S）-Rg3 上调脯氨酰羟化酶结构域蛋白1，促进缺氧诱导因子1α 泛素蛋白酶体在正常氧水平下的降解，降低缺氧诱导因子1α 的表达，从而在体外和体内发挥抑制癌细胞迁移作用。

4、GRg3抑制血管生成

将小鼠肝癌细胞Hep1-6植入小鼠肝脏，构建肝原位癌模型，小鼠口服GRg3（10 mg∕kg，1 次∕d，连续30 d），通过CD105 染色血管计数测定肿瘤血管生成定量（MVD）。GRg3 组肿瘤血管MVD-CD105 阳性染色明显少于对照组［13］。另一肝癌大鼠模型结果显示，GRg3联合TAE 降低肝癌大鼠模型中血管生成及VEGF、CD31、VEGFR2 的表达［20］。在兔VX2 肝癌模型中，GRg3 联合TAE 组表达的CD31 和VEGF 水平显著降低。体外实验，GRg3 显著下调HepG2 细胞VEGF 表达。结果表明，GRg3 联合TAE 可通过抑制肿瘤血管生成而有效抑制肿瘤生长［21］。大量研究表明，GRg3 通过抑制VEGF、VEGFR 表达剂量依赖性抑制人脐静脉内皮细胞、内皮祖细胞管型形成及微血管出芽［39］。

结 论

GRg3 体内外实验研究及参一胶囊的临床应用均证明其有良好的抗肝癌活性。GRg3 抗肝癌的作用机制是多方面的，包括诱导肝癌细胞凋亡、调控自噬逆转耐药、抑制细胞侵袭及转移、抑制血管生成等。但对GRg3抗肝癌的作用机制有待进一步深入研究，新的制剂形式也有待进一步开发以发挥抗肝癌作用，延长晚期肝癌患者的生存期。