凡纳滨对虾弧菌病及其防治方法研究进展

李君怡 吴秋平 周疆 王梅芳 邹记兴 范兰芬

(华南农业大学海洋学院，广州 510642)

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)隶属于对虾科、滨对虾属，原产于美洲，又称南美白对虾，因其具有产量高、生长快和环境适应性好等特点，现已成为世界养殖产量最高的三大虾类品种之一。该虾于1988年被引入我国，目前其海水养殖区域主要集中在华南、东南沿海[1]。2018年我国凡纳滨对虾的养殖产量为111.75万t，占海水养殖虾类产量的79.31%[2]。但随着集约化养殖的发展和生态环境的恶化，一些环境压力源、高毒细菌或病毒导致对虾疾病频繁暴发，给对虾养殖业造成了巨大损失。在细菌性疾病中尤以弧菌病、气单胞菌病和链球菌病最为常见[3]。

弧菌(Vibrio)属于革兰氏阴性细菌，常在海洋和河口环境中被检测到。多数弧菌具有兼性厌氧、化能异养等特征，大多具有单生极性鞘状鞭毛[4]。目前共发现126种弧菌和2种亚种，其中有近100种是水生环境中的土著弧菌[5]。有多种弧菌对人和动物均具有致病性[6-9]。其中霍乱弧菌(V.cholerae)引发了历史上几次大规模霍乱疫情暴发，给人类造成了严重损失[10]，而副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)能引起水生动物大量死亡，也是食源性肠胃炎最主要的病原之一[11]。据统计，从2009年到2018年，仅亚洲虾类养殖业每年就因对虾病害遭受高达40亿美元的损失[12]。Flegel等[13]估计，虾产量60%的损失是由感染白斑综合征病毒(WSSV)等病毒引起的，而20%是由细菌性病害引起的，而细菌性病害主要就是由弧菌属细菌引起的弧菌病。弧菌病因此被认为是对虾养殖业的一个持续性的威胁。

在已知的弧菌种类中，哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和霍乱弧菌是与对虾弧菌病相关的重要病原体之一。这些病原体自对虾养殖初期就一直存在并感染对虾[14]。患弧菌病的虾一般表现为生长缓慢、幼虫变态率低、身体畸形、附件坏死、鳃呈红色或棕色、肌肉混浊、身体发红、游泳行为异常(观察到虾在池边或水面游泳)、生物发光、黑色素化、空肠和厌食等，且环境水质的恶化与弧菌的暴发往往相辅相成[15-17]。本文分别对海水养殖中常见的哈维氏弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌这4种弧菌的研究进展及相应弧菌病的治疗和预防进行综述，以期为凡纳滨对虾养殖中弧菌病的防治和监控提供参考。

1 弧菌病原介绍

1.1 哈维氏弧菌

哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性菌，整个菌体呈现弧状，只有单鞭毛，在近岸温暖海洋环境中广泛分布，能感染多种海洋无脊椎和脊椎动物[18]。水生动物受到该菌感染后大多会出现厌食、体表出血、眼球突出等症状，严重感染者还会出现皮肤和肌肉腐烂、鳞片脱落、脾脏膨胀等症状[19]。研究表明，哈维氏弧菌可以通过脂多糖[20]、外毒素[21]、溶血素[22]和蛋白酶[23]等胞外产物(extracellular products，ECP)致病。与许多弧菌一样，哈维氏弧菌的毒力受群体感应系统的调节，该系统能够调节毒力因子，如生物膜的形成和运动、铁载体的产生、细胞外产物和III型分泌系统(type III on system，T3SS)[24]。在弧菌感染宿主初期，T3SS位于弧菌表面，只有在弧菌与宿主细胞接触后才被激活，整个系统由装置蛋白、转位子蛋白、效应蛋白及T3SS分子伴侣构成[25]。T3SS依靠接触宿主细胞激活，将效应蛋白注入宿主细胞，从而影响宿主正常新陈代谢及功能。保守存在于不同革兰氏阴性菌中的T3SS，其效应蛋白存在着较多区别，会作用于不同的细胞靶蛋白，诱导不同的细胞死亡方式。对虾哈维氏弧菌感染可表现为不同的疾病状态，包括“鲜红综合征”“细菌性白尾病”“发光弧菌病”等。虽然病症各不相同，但患病对虾一般都会变得厌食，身体松弛，腹部角质层出现多灶性红色斑点并伴有烂身[25]。

1.2 溶藻弧菌

溶藻弧菌常存在于海洋和河流的河口，可引发海洋中脊椎动物和无脊椎动物的弧菌病，严重威胁着全世界渔业和水产养殖的发展[26]。由于抗生素的滥用，在水产养殖产品和环境中广泛存在并传播着耐药性细菌和抗性基因[27]。Hernández-Robles等[28]从墨西哥城一家食品市场获得的牡蛎样品中分离得到溶藻弧菌，表明其对抗生素具有多重耐药性。Lajnef等[29]通过对突尼斯不同海洋生物群落(海滩水域、水产养殖场及1条寒冷季节与海水相连的河流)中分离得到69株对氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素具有耐药性的溶藻弧菌，这些抗性基因可以在菌株的质粒中编码，也可以在其他菌株的染色体中编码。在对虾育苗期，对虾在从无节幼体变态发育为溞状幼体期间容易感染一种疾病，其临床体征为不蜕皮、嗜睡、游泳行为不规律、摄食减少或食欲不振等。研究表明，溶藻弧菌是该病的主要病原体，该弧菌极易侵染溞状幼体，且短时间内可导致幼体全部死亡[30]。

1.3 霍乱弧菌

霍乱弧菌是一种革兰氏阴性菌，也是极易造成大规模传染病的重要的病原体。据报道，每年感染霍乱弧菌的病例数以百万计，而且死亡率极高[31]。作为一种重要的食源性病原菌，霍乱弧菌广泛分布于河口、海洋沿海水域以及鱼、虾、贝类等各种软体动物中，给人类健康和水产品质量卫生带来严重的安全隐患[32]。大量的研究报道表明，目前世界各地霍乱弧菌的防治情况仍然极为严峻[33-34]。在对虾养殖中期，白便综合征(俗称“白便病”)在南美白对虾养殖区频发，其典型病症为肝胰腺肿大，严重者糜烂；空肠或断肠；粪便呈白色棉线状、有黏性并浮于水面。该病发病率高，传染性强，对养殖对虾的危害性很强，也对整个南美白对虾产业链造成了严重的影响，而霍乱弧菌便是该病的主要病原菌[35]。

1.4 副溶血性弧菌

虽然霍乱弧菌的危害性很大，但是最为常见的却是副溶血性弧菌。该菌被认为是一种重要的人类的食源性病原体。人体感染该菌的主要途径是食用未加工或未煮熟的贝类，极少数情况下，副溶血性弧菌也会引起伤口感染[36]。研究发现，食用受到感染的水产养殖动物后，患者一般会表现出明显的恶心、呕吐、肠痉挛和腹泻等胃肠道的临床症状[37]。此外，副溶血弧菌引起的凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)曾给对虾养殖业带来巨大的灾难和损失[36]。研究表明，被AHPND感染的虾有明显的空肠、空胃、肝胰腺发白等特征，病理学观察发现，病虾出现肝胰腺小管崩塌、上皮细胞严重脱落等症状，而且感染之后往往会在短期内大面积暴发虾病，引起大规模死亡[38-39]。

2 对策与建议

2.1 噬菌体控制病原菌

早在2014年，世界卫生组织(WHO)就对抗生素抗药性提出了警示。据报道，弧菌属的几个菌株均已出现抗生素抗性[40-41]，但尚未发现有效的治疗方法。试验发现，裂解性噬菌体杀死病原菌或可成为控制弧菌病的最有希望的选择之一[42]。噬菌体是地球上最丰富的生物实体之一，在细菌的进化中发挥着重要作用[43-44]。与抗生素不同，噬菌体具有特异性，它们的应用不会干扰非目标细菌物种。此外，噬菌体具有无毒性和自我限制的特点，仅当宿主细菌存在时才会留在环境中[45]。因此，将其开发为控制耐药性细菌的病原体是一种极为可行的策略。有研究认为，噬菌体也是一种复杂的工具。例如，可将哈维氏弧菌的毒力与温和噬菌体联系起来，某些噬菌体可介导哈维氏弧菌毒性，使其毒力基因转移，将哈维氏弧菌无毒株变成有毒株[46]。

2000年，Oakey等[47]研究发现了能够侵染哈维氏弧菌的噬菌体VHML，但这种噬菌体不适合用于噬菌体治疗，因为它的存在可能会使其他几株哈维氏弧菌具有毒力。2006年，从养虾场水域分离到的噬菌体证明，与未感染噬菌体的幼虫相比，感染哈维氏弧菌噬菌体的斑节对虾单足类幼虫的活力提高了80%[48]。这一尝试首次证明了噬菌体的潜在用途——控制水产养殖中的弧菌病原体。随后，有学者对不同种类的弧菌采用了相似的方法。Silva等[49]以斑马鱼(Daniorerio)幼鱼为感染模型，他们发现，当细菌和噬菌体同时感染时，幼鱼死亡率低于3%，而未添加噬菌体的感染幼鱼死亡率为17%(但较低的死亡率也可能是因为斑马鱼不是鳗弧菌的共同宿主)。Chen等[50]从患病凡纳滨对虾的肠道和养殖废水中分离到20株弧菌(对虾致病菌)，并以5种病原菌为寄主分离得到了5个长尾噬菌体科(Siphoviridae)的新噬菌体，研究发现，由这5个噬菌体组成的“噬菌体鸡尾酒”(即噬菌体组合物)对致病性弧菌生长有较好的抑制效果。该报道还介绍了制备“噬菌体鸡尾酒”并将其应用于对虾养殖细菌感染防控的一般工作流程。以上研究结果表明，噬菌体疗法可以作为一种替代方法，以保护鱼虾类水产动物在不同生长阶段受到细菌感染。但目前噬菌体疗法还处于研究阶段。有试验表明，噬菌体侵染具有高度特异性，当水体中弧菌浓度降低到一定程度时，噬菌体无法再起作用。这一现象也说明噬菌体无法像抗生素一样具有广谱抗菌性，这也是此方法的一大缺陷所在[51]。

2.2 中草药对细菌病的治疗

为了控制养殖过程中细菌的增殖，在集约化养殖中，预防性的化学治疗被广泛应用。然而，广谱抗菌药的滥用导致了耐药性细菌数量的上升，这些细菌的耐药基因有转移或通过病毒感染陆地动物和人类的风险[52]。过度接触化学药物所带来的副作用已成为共识，并引起人们对安全并生态友好的药物研发的关注，因此有必要探索一种非化学方法来代替化学方法。例如从植物中寻找可使用的疫苗、益生菌、免疫刺激剂和自然疗法[53-54]。药用植物现已受到了众多研究人员的关注，相对于化学治疗药物，它们对水生动物和环境更安全[55-56]。此外，药用植物资源丰富，易于制备，有助于投入生产应用[57]。不同作用模式的化学治疗药物和中草药的组合具有治疗许多疾病的应用潜力，药物组合可以大大降低药物耐药性发展的可能性并提高疗效[58]。因此，为了达到更好的预防和治疗效果，许多研究人员将重点放在中药和化学药物的联合使用上。Yeh等[54]用台湾牛樟(Cinnamomumkanehirae)叶和枝提取的精油和水提取物对凡纳滨对虾进行抗菌保护作用研究，发现其有显著的抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的作用，其中牛樟枝的水提取物可降低凡纳滨对虾对溶藻弧菌的敏感程度，并大幅提高酚氧化酶活性和血细胞吞噬活性。李青霞等[59]采用不用方法提取五倍子的有效成分，并将提取物添加到对虾饲料中，结果表明，添加1%的五倍子水提取物抑菌效果最好，且连续拌饲喂养5 d效果最佳。

采用中草药防治细菌性疾病依然存在一些问题需要完善，例如已有的同种中草药添加剂产品标准混乱。市场调查发现，不同企业开发的产品往往中草药含量差距巨大，产品市场混乱。近年来科研工作者研究探索了大量不同种类的中草药提取物添加剂，但是真正开发成产品的极少，主要问题是没有完善的成果转化条件。今后科研机构需加强与企业的合作，研发新产品[60]。

2.3 相关疫苗对细菌病的预防

目前，国内已有许多有关弧菌疫苗尤其是亚单位疫苗和灭活疫苗的研究。疫苗可以形成免疫刺激，是一种有效增强机体的疾病抵抗力和免疫力的方式[61]。丁燏等[62]采用福尔马林的方法将溶藻弧菌灭活，从而获得了溶藻弧菌的一种全菌疫苗，接种疫苗之后的试验证明，这种福尔马林灭活法得到的灭活疫苗可以显著提高黄鳍鲷(Sparuslatus)对弧菌的抵抗力和免疫力，攻毒试验证明，获得免疫后，黄鳍鲷的存活率明显提高。徐在超[61]结合其对虾肠道菌群的高通量测序分析结果，通过冰核蛋白表面展示技术成功地搭建了WSSV的囊膜蛋白VP28表面展示系统，证明采用冰核蛋白或其他蛋白作为运载蛋白进行目的基因的表面展示，进而构建载体疫苗是具有一定可行性的。然而，开发用于商业用途的疫苗并非一蹴而就的任务，尤其是针对虾类特有的适应性免疫方面仍有许多有待发现的地方，应进行详细和彻底的研究，进一步了解其潜力，同时开展更多的现场试验研究，以进一步验证疫苗在对虾生产中预防细菌性疾病的有效性[63]。

3 展望

弧菌作为革兰氏阴性菌群中的一员，一直被认为是对虾细菌病最主要的病原体。现阶段针对致病性弧菌的防治手段已开展了多方面的研究探索，其中环境友好型的防治方法越来越受到重视。生物防治手段具有无毒、绿色、环保等诸多优点，也能让广大消费者对水产品安全具有信心。细菌类疾病最好的治疗方法就是预防感染。应激是诱发虾病的重要因素，养殖过程中应尽可能避免虾类产生应激反应。在生产过程中可实施有效的养殖水体管理方法和适当的消毒措施来预防病害，避免弧菌进入养殖区。同时建议通过轮捕轮放、定期换水、池塘干燥和施用石灰来减少池塘生物量，降低弧菌大面积繁殖暴发的概率[64]。在未来针对弧菌病的预防和治疗的相关研究中，应当更加关注养殖环境的维护，做好对养殖水质的监测，做到预防大于治疗；及时检测在防治过程中对环境造成的危害；更加重视致病性细菌对抗生素形成的抗性基因；研发更多、更灵敏、更高效的弧菌疫苗，采取特异性较强的弧菌疫苗替代对环境产生高污染的化学抑菌方法，在高效抑菌的同时降低对水体环境的污染；采取化学药物与中草药搭配使用的方法，研究分离其中的一些有效成分和与抗菌抑菌有关的提取物；研制全新的高效、无毒、无污染、绿色的微生物制品，以期能够在水产养殖弧菌病的防治方面取得突破。在发现超级细菌的情况下，噬菌体是控制致病性弧菌的十分高效又安全的手段。对于以上的一些防治手段，仍存在需要解决或完善的问题，例如制作疫苗的技术复杂性，种植和运输中草药的不稳定性，以及噬菌体的应用对象的广谱性等。