PD-L1 表达与三阴性乳腺癌临床病理关系探究

林 伟， 陈仲辉， 李金秋， 李 魁， 方建禅， 陈 宇*

( 1. 莆田学院附属医院 中心实验室， 福建 莆田 351100 ；2. 莆田学院附属医院 乳腺外科， 福建 莆田 351100 )

乳腺癌是威胁全球女性健康的第一大恶性肿瘤， 是导致女性死亡的第二大原因[1]。 2019 年国家癌症中心发布了中国地区恶性肿瘤的发病情况， 乳腺癌以17.1%的发病率高居我国女性恶性肿瘤首位， 成为威胁女性身心健康的主要疾病之一[2]。 三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是以缺乏雌激素受体(ER)、 孕激素受体(PR)的表达和人表皮生长因子受体-2(HER2)过表达为特征的乳腺恶性肿瘤， 占乳腺癌发病率的15%～20%[3]。 因缺乏有效的治疗靶点， 目前主要使用细胞抑制剂进行化疗， 但预后较差， 转移性 TNBC 患者的5 年生存率低于30%， 死亡率高[4]。 因而寻找一种新型、 更加有效的治疗药物迫在眉睫。

程序性死亡配体1(Programmed death ligand 1，PD-L1)是一种40 kDa 的跨膜蛋白， 在血管内皮细胞、 上皮细胞、 自然杀伤细胞、 巨噬细胞、髓样树突状细胞和B 细胞上表达， 在肿瘤细胞免疫抑制和免疫逃逸中起着重要作用[5]。 PD-L1与程序性死亡受体1(PD-1)结合时， 可阻断T 细胞活化、 迁移、 增殖和分泌， 介导 T 细胞的凋亡[6]。 目前相关研究表明， PD-L1 是众多癌症不良预后的生物标志物， 其过表达与肿瘤的复发、转移相关[7]。

PD-L1 表达与乳腺癌临床病理及预后的相关性， 目前也受到了国内外众多学者的关注。 但截至目前， 仍少有针对PD-L1 与TNBC 临床病理相关性的研究报道， 而TNBC 是乳腺癌中最具免疫原性的一种亚型， 有20%～30%的 TNBC 出现PD-L1 表达[8]。 因此本实验探讨 PD-L1 与 TNBC临床病理的相关性， 为TNBC 患者的远期生存预测及治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验对象

选取我院 2019 年 1 月—2021 年 7 月 88 例首次经病理确诊为TNBC 患者的病理组织。 所有患者均无全身其他部位恶性肿瘤个人史， 在确诊前未接受化疗、 放疗、 内分泌治疗、 靶向治疗等综合治疗措施的女性。

1.2 实验方法

1.2.1 组织离体保存与观察

将上述病理组织经10%的福尔马林固定和石蜡包埋等处理后保存； 将保存的蜡块进行免疫组化实验后， 利用中性树胶进行封片， 待切片干燥后利用显微镜观察。

1.2.2 细胞染色结果判读

前提: 以扁桃体作为质控片， 阳性质控片染色结果为阳性， 阴性质控片染色结果为阴性。1)阳性: 组织切片中细胞膜部分或完全染色，呈现出黄褐色或棕色； 肿瘤巢内或相邻滋养基质层内， 直接与肿瘤反应相关的淋巴细胞或巨噬细胞细胞膜染色； 背景无染色。 2)阴性: 组织切片中细胞无黄褐色或棕色染色； 或仅细胞质染色。 联合阳性分数(combined positive score，CPS)为任何强度PD-L1 膜染色的肿瘤细胞占整个肿瘤细胞中的百分比。 计数的TNBC 细胞总数≥100 个。 若 CPS≥1%， 则判定 PD-L1 阳性； 若CPS＜1%， 则判定 PD-L1 阴性。

以上所有组织切片均经我院病理科两名副主任及以上医师阅片确认。

1.3 统计学分析

使用SPSS 25.0 统计分析软件和GraphPad Prism 8 绘图软件对数据进行分析， 所有数据采用“均值±标准差” (ˉx ± s) 表示， 组间比较采用皮尔逊卡方检验和费希尔精确检验， 以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 88 例 TNBC 的基本特征

本实验所用病理组织来自于我院88 例经病理证实为TNBC 的患者。 同期确诊为乳腺癌的患者共 574 例， TNBC 患者占 15.3%。 88 例 TNBC患者的平均患病年龄为49.58 ± 12.76 岁； 肿瘤大小以 1 ～4 cm 居多， 平均 2.48 ± 0.98 cm； 淋巴结转移方面， 多数患者淋巴结转移小于5 个，平均2.55 ± 5.40 个， 淋巴结阳性患者差异程度大； 组织学分级上均为Ⅱ级或Ⅲ级， 以Ⅲ级为多见； Ki-67 表达水平集中分布在40%～90%， 平均56.61% ± 22.41%； 身体质量指数(BMI)平均值为 23.62 ± 2.70 kg·m-2， 接近中国人群肥胖阈值 24 kg·m-2[9]。

2.2 PD-L1 表达与TNBC 临床特征的相关性

88 例 TNBC 患者中， 共检出 23 例 PD-L1 阳性， 阳性率为26.1%。 PD-L1 阳性患者多数年龄＞35 岁、 已绝经、 肿瘤直径≤2cm、 位于乳腺外上象限、 无淋巴结转移。 患者的年龄、 绝经状态、 肿瘤大小、 肿瘤发生部位和 BMI 与PD-L1表达未表现出明显的相关性(P ＝0.085、0.150、0.102、0.569、0.840) ； 但 PD-L1 的表达情况与淋巴结转移有着相关性(P ＝0.014)。 淋巴结N0、“≥N2” 与 N1相比， 差异均有统计学意义； N1组内对比， PD-L1 阳性及阴性， 也存在着统计学上的差异； 根据两者的标准残差可以进一步得出， PD-L1 表达和淋巴结N1水平显著相关， N0、“≥N2” 组内未显现出统计学上的差异。 见表1。

表1 PD-L1 在TNBC 中的表达与临床病理特征的关系

2.3 PD-L1 表达与TNBC 病理特征的相关性

88 例TNBC 患者的病理组织均呈现出高组织学分级及高Ki-67 表达， 组织学Ⅲ级和Ki-67＞30%的占比分别为64.8%、 78.4%。 在与PD-L1表达的相关性方面， 组织学Ⅱ级与Ⅲ级存在统计学上的差异(P ＝0.000)； PD-L1 表达与 CK5/6不同表达情况也有着显著的统计学上的相关性(P ＝ 0.000)； 而 EGFR、 脉管癌栓和 Ki-67 与PD-L1 表达无统计学上的相关性(P ＝0.230、0.390、0.564)。 见表 1。

2.4 PD-L1 表达在TNBC 病理组织中的表达分析

TNBC 病理组织中PD-L1 表达情况的免疫组化分析结果见图1。 图1(a)、 (b)选取扁桃体组织作为阳性质控对照组， 可见扁桃体隐窝上皮细胞膜染色强阳性， 生发中心的巨噬细胞染色为中等到弱阳性， 内皮细胞、 纤维细胞和表面上皮细胞的细胞膜则没有染色； 图1(c)、 (d)是利用阴性对照抗体试剂进行染色， 未见乳腺癌上皮细胞膜染色；图1(e)、 (f)在显微镜视野下可见细胞膜染色为黄褐色， 呈强阳性， 染色均匀、 数量多、 效果佳，而周围纤维组织细胞未见染色； 图1(g)、 (h)可见肿瘤细胞质染色为棕色， 表现为染色假阳性。

图1 TNBC 病理组织中PD-L1 表达情况的免疫组化分析

3 分析

TNBC 是乳腺癌中预后较差的一种亚型， 目前治疗手段有限， 因而亟需探索新型、 更加有效的治疗TNBC 方案[10]。 免疫治疗近年来在癌症治疗方面取得令人瞩目的成果， 在TNBC 治疗方面也展现出极大的潜力[11]。 研究发现， TNBC 肿瘤细胞中PD-L1 表达较高， 而PD-L1 是免疫治疗中重要的靶点[12]。 针对TNBC 的免疫治疗药物， 目前美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的有两种PD-1 抑制性抗体药物: Pembrolizumab 和Atezolizumab。 国内外多个中心正在开展关于这两种药物的大型临床研究， 截至目前，多数研究中心的数据显示PD-L1 免疫治疗可以进一步改善TNBC 患者的远期生存， 展现出令人满意的结果[13]。 但是鲜有针对 PD-L1 与 TNBC的临床病理相关性的研究报道。 本实验就我院88 例TNBC 患者的临床病理特征与PD-L1 表达情况进行研究， 探讨PD-L1 表达与TNBC 临床病理特征的相关性。

本实验， PD-L1 在 TNBC 中的阳性率为26.1%， 与相关研究相符。 年龄小、 肿瘤大通常提示TNBC 患者有不良预后[14]。 超重(甚至肥胖)与多种调节肿瘤发生和发展的途径相关， 能增加TNBC 发病率和死亡率， 被认为是影响预后的重要危险因素[15]。 但本实验中患者的发病年龄相较于乳腺癌的总体水平(45 ～54 岁)， 未表现出年轻化的趋势。 而与PD-L1 表达的关系方面， TNBC 发病年龄、 肿瘤大小和BMI 均未表现出相关性。 国内一项涉及14 367 名乳腺癌患者的meta 分析中， 也未发现PD-L1 表达与乳腺癌患者年龄具有相关性[16]； ZHU 等的研究同样指出年龄与TNBC 中PD-L1 的表达无明显相关[17]。GUO 等的研究发现肿瘤大小与PD-L1 表达无明显相关[18]。 但 BMI 与 PD-L1 表达的关系， 目前研究甚少， 因而两者的关系需待更多的报道去验证。 从以上的结果可以发现， 虽然年龄小、 肿瘤大、 高BMI 与TNBC 的不良预后相关， 但与PDL1 表达并未显现出相关性， 说明TNBC 的不良预后因素， 并非与影响PD-L1 表达的因素呈正性相关。

淋巴结转移往往预示着TNBC 患者已处于疾病中晚期， 远期生存率低， 疾病复发率高。 研究发现， N0、 “≥N2” 的淋巴结转移， 较 N1更易表达 PD-L1， 但 N0与 “≥N2” 两者并未表现出差异， 表明虽然淋巴结转移与PD-L1 阳性相关，但转移数量并非与PD-L1 阳性呈正比， 进一步说明PD-L1 并不是和TNBC 的不良预后呈正相关。 在 N1组中， 只有少部分 PD-L1 阳性， 也提示PD-L1 阳性与不良预后并无一致性。

病理检查是诊断乳腺癌的金标准， 不仅能够明确肿瘤的性质， 其中的生物分子信号还能预测患者的预后， 为癌症患者的诊断及治疗提供巨大帮助。 组织学分级程度越高， 一定程度上说明TNBC 恶性程度越高， 高组织学分级也是乳腺癌化疗的重要参考指标之一。 实验中， 88 例TNBC患者共有57 例组织学分级为Ⅲ级， 占64.8%，说明TNBC 患者的不良预后风险相对较高。 组织学Ⅲ级相对于Ⅱ级患者更易表达PD-L1， 说明在组织学上， PD-L1 阳性能对患者的预后提供一定的参考。 C-kit 是一种跨膜酪激酶受体， 存在于造血干细胞和其他细胞表面， 具有诱导细胞凋亡和增加癌细胞侵袭性的能力[9]。 本实验中，CK5/6 阳性患者与阴性患者的PD-L1 表达存在着统计学上的差异， CK5/6 阳性患者 PD-L1 阳性率更高， 在某种程度上PD-L1 可能与肿瘤的侵袭能力有关。 脉管癌栓、 Ki-67 水平虽然也与TNBC 患者的不良预后相关， 但实验中未表现出与PD-L1 的表达存在着相关性， 而国内外目前的研究也较少涉及这个层面， 因而仍需更多的数据进行探讨。

综上所述， PD-L1 表达与淋巴结转移、 高组织学分级、 CK5/6 表达有着一定的相关性， 但在预测TNBC 预后方面仍存在缺陷。 目前有相关报道指出， 肿瘤浸润淋巴细胞与PD-L1 联合研究时， 能更好地预测患者的预后[19]， 待今后进一步探究。