主动脉夹层组织中载脂蛋白H表达变化及其临床意义

冯鑫 何毅 肖杰文 蒋丁胜 魏翔

主动脉夹层(aortic dissection,AD)是一种因高血压、动脉粥样硬化及脂代谢紊乱等多种危险因素引起的主动脉危急重症，主动脉内膜形成撕裂破口，动脉腔内血液经撕裂破口进入中层膜，致使中层膜撕裂形成真假腔[1-2]，起病急，进展迅速，死亡率极高。有研究显示，主动脉夹层的院内30天病死率高达21%～26%，院外病死率高达29%[3]。主动脉夹层的治疗方式主要包括手术治疗以及降低血压，降低心率等辅助治疗[4-5]。主动脉夹层发生过程中存在明显的脂代谢紊乱，例如高密度脂蛋白和低密度脂蛋白[6]。载脂蛋白H(apopoprotein H,ApoH)也称为β2-糖蛋白I(beta2glycoprotein I,β2GPI)，是脂蛋白的蛋白质部分，参与脂质代谢及凝血功能等多种生理途径。ApoH与心血管疾病密切相关[7-8]，是血管栓塞、动脉粥样硬化及冠心病等疾病的危险因素之一，可作为评估心血管风险的临床指标。本研究观察正常主动脉壁及夹层主动脉壁中ApoH表达量的变化，探讨其在主动脉夹层发生过程中的作用及临床意义。

对象与方法

一、对象

2015年8月～2020年1月我院心脏大血管外科住院的Stanford A型主动脉夹层(Stanford type A aortic dissection,TAAD)病人15例，行人工血管置换术中修剪的升主动脉壁作为夹层组。排除标准：遗传性主动脉病变(如马方综合征等)、医源性及创伤性TAAD。9例心脏移植或心肺移植病人术中修剪的正常升主动脉壁作为对照组。术前所有病人均签署知情同意书，并获得我院伦理委员会批准。

二、方法

1.苏木精-伊红(HE)染色和弹性纤维(EVG)染色：将采集的主动脉组织固定于4%多聚甲醛中，经脱水、包埋成蜡块后切片，切片厚度为5 μm，依次按脱蜡、水合及染色等处理切片，分别完成HE和EVG染色，脱水封片后镜下观察。

2.蛋白质免疫印迹法(Western blot)：将两组升主动脉标本各取500 mg，剪碎、研磨，加入200 μl RIPA裂解缓冲液，裂解30分钟后4 ℃ 12 000 r/min离心5分钟，取上清转移于EP管。使用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。蛋白定量，电泳，转膜。室温下5%脱脂牛奶封闭1小时，加入一抗ApoH，4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液清洗(5 分钟×3次)后加入相应二抗，室温下孵育1小时，ChemiDOCTMXRS+凝胶成像系统显影，Image Lab软件对条带进行灰度值分析。

3.免疫组织化学染色法：石蜡切片经脱蜡水合后浸泡于1×的抗原修复液(EDTA法)中，100 ℃水浴锅中加热20分钟，3%双氧水37 ℃孵育40分钟，PBS清洗2次，5%山羊血清37 ℃封闭20分钟，ApoH一抗(1∶50稀释)4 ℃孵育过夜。次日PBS清洗3次，反应增强剂37 ℃孵育20分钟，PBS清洗2次，二抗37 ℃孵育30分钟，PBS清洗3次后行DAB显色液显色、苏木素染核、盐酸酒精分化、脱水、透明、封片及镜下观察拍照。

三、统计学分析

结果

1.两组病人组织样本病理学染色分析比较： HE染色及EVG弹力纤维染色结果显示，对照组主动脉壁组织结构规整，弹力纤维完整连续，平滑肌细胞形态正常，排列紧密有序；夹层组主动脉中层结构紊乱，表现为明显的退行性病变、平滑肌细胞丢失、炎症细胞浸润及弹力纤维碎裂(图1)。弹力纤维破裂程度分级结果显示，夹层组主动脉组织弹力纤维断裂和内侧降解程度明显高于对照组[(1.000±0.000)比(3.208±0.806)]， 差异有统计学意义(P<0.05)。

A 对照组，可见主动脉壁结构完整，平滑肌细胞排列有序(HE ×200)。B 夹层组，主动脉壁组织发生中层退变，平滑肌细胞减少排列紊乱(HE ×200)。C 对照组，主动脉壁弹力纤维完整连续(EVG ×200)；D 夹层组，主动脉壁弹力纤维破碎、断裂和丢失(EVG ×200)。

2.两组间ApoH蛋白表达比较见图2。夹层组ApoH蛋白表达量为1.455 ± 0.128，对照组为1.001 ± 0.060，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析显示，ApoH的蛋白表达水平与主动脉夹层患者的升主动脉直径(R2<0.001,P=0.99)、主动脉弓直径(R2=0.162,P=0.322)及胸主动脉直径(R2=0.459,P=0.065)无明显相关性。

两组主动脉组织中ApoH蛋白表达情况和组织总蛋白表达情况

3.两组间ApoH在主动脉组织中的细胞定位和表达量比较：免疫组织化学染色发现，ApoH主要分布于平滑肌细胞胞质内(图3)。夹层组主动脉组织中ApoH表达量为(13.49 ± 0.948)，对照组为(1.616 ± 0.057)，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

A、C、E分别为对照组主动脉壁组织100倍、200倍400倍免疫组织化学染色结果。B、D、E分别为夹层组主动脉壁组织100倍、200倍、400倍免疫组织化学染色结果。ApoH表达呈棕色，对照组的平滑肌细胞中未见明显棕色物质，夹层组平滑肌细胞中棕色物质明显增多，且主要分布在细胞质中。

讨论

主动脉夹层的主要病理特征是主动脉中层退行性病变，包括平滑肌细胞丢失及弹力纤维断裂等[9]。ApoH出现异常会引起多种心脑血管疾病如动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中及血管内血栓形成等[7-8]。本研究发现，ApoH在TAAD病人主动脉组织中表达明显上调。

ApoH又称为β2GPI，是一种由肝细胞合成的多功能血浆蛋白，基因定位于17q23-24，参与脂质代谢及炎症反应等多种病理生理过程[10]。Tan等[10]研究发现，ApoH表达上调可通过抑制P-Erk信号通路诱导血管内皮功能障碍，影响血管发育。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)的蓄积可以促进内皮细胞凋亡，是引起动脉粥样硬化的重要因素[11]。李文[6]等研究发现，低密度脂蛋白在主动脉夹层中表达上调，其经过氧化应激可变成oxLDL。氧化应激与主动脉夹层密切相关，可诱导主动脉中层发生退行性病变，导致主动脉壁变薄[12]。有研究表明，ApoH与oxLDL结合可诱导巨噬细胞向泡沫细胞分化，促进细胞内活性氧及凋亡相关蛋白Bax表达升高，进而促进细胞凋亡[13]。主动脉夹层的主要病理特征之一是平滑肌细胞丢失，而细胞内ROS升高及细胞凋亡均可以导致平滑肌细胞丢失[14]。有研究表明，血管发育障碍、动脉粥样硬化及脂质代谢异常等均与主动脉夹层的发病机制密切相关[14-15]。在本研究中，TAAD病人主动脉组织中ApoH蛋白表达水平升高，表明ApoH在主动脉夹层形成的病理过程中具有调控作用，可能通过调控P-Erk信号通路导致血管发育不良，从而促进主动脉夹层形成，也可能通过与oxLDL结合调控Bax表达诱导平滑肌细胞凋亡，影响主动脉夹层的发生。相关性分析揭示了ApoH的表达变化与主动脉直径无显著相关性，表明ApoH可能与主动脉夹层的形成有关，但与主动脉夹层的进展无关[16]。ApoH被发现与多种心血管疾病密切相关，可作为临床上评估心血管疾病风险的指标。