牛支原体检测方法初探※

●梁月梅 杨 乐 吴翠兰 彭 昊 李军※※

（1.南宁市江南区动物疫病预防控制中心 广西 南宁 530031；2.广西益多乐生物科技有限公司 广西 南宁 530007；3.广西兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室 广西 南宁 530001）

牛支原体是柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属的成员，是一类缺乏细胞壁、能通过0.22 μm的孔径的无细胞培养基生长的原核生物[1-2]。牛只感染支原体可引起牛肺炎、乳房炎、关节炎、乳腺炎、耳炎、眼结膜炎等多种疾病，其中肺炎和乳房炎对养牛业的危害最为严重，给养殖业造成巨大的经济损失[3-6]。近年来，广西部分地区将肉牛作为支持乡村振兴的发展产业，由于省内肉牛资源缺乏，需要从省外引购，因此，肉牛的频繁贸易便引起牛支原体的传播流行[7-9]。为了解肉牛贸易中牛支原体的流行状况，本研究采用PCR和支原体分离的方法，对某肉牛场从省外引购的肉牛进行牛支原体检测，以期了解跨省区引进肉牛的牛支原体的感染情况，为牛支原体的综合防治提供数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源2021年11月，从广西某肉牛场采集牛鼻拭子60份。该批牛从省外引进1周后陆续有牛发病，表现为体温升高，可达41℃左右，呼吸急促，流鼻涕，部分牛只咳嗽。

1.1.2 主要试剂和仪器PPLO肉汤购自杭州百思生物技术有限公司；马血清购自广东蕊特生物科技有限公司；细菌基因组提取试剂盒、2×TaqMasterMix （Dye）等购自北京康为科技发展有限公司；PCR仪、凝胶成像系统为Bio-rad公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计采用吴翠兰等[7]方法进行合成引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 病料处理将采集的60份鼻拭子分别加入适量的PBS，然后各分为2份，1份用于病原增殖，1份用于PCR扩增。

1.2.3 病原增殖加有PBS的鼻拭子利用0.45 μm滤膜进行过滤，加入适量PPLO培养液，置于含有5% CO2培养箱中37℃培养3～5 d后，再划线接种于PPLO固体培养基表面，置于含有5% CO2培养箱中37℃培养3～5 d后观察固体培养基上菌落生长情况。

1.2.4 PCR扩增按照细菌基因组提取试剂盒对处理的鼻拭子提取DNA，以此为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL，包括2×TaqMasterMix （Dye） 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 扩增程序：95℃预变性 5 min；95℃变性30 s，退火 55℃ 40 s，72℃延伸50 min，30个循环；72℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 病原增殖结果

经培养3～5 d，PPLO液体培养基由红色逐渐变黄色；PPLO平板上肉眼可见极小的针尖状菌落，在低倍显微镜下观察固体培养基上菌落的形态，呈典型的支原体“煎蛋样”菌落，共分离出2株支原体（图1）。

图1 支原体菌落形态（4×）

2.2 PCR扩增结果

60份鼻拭子采用PCR的方法进行检测，结果显示有19份能扩出相应的目的条带（图2）。同时将上述分离出的2株支原体经PCR检测，也扩出了相应的目的条带。

图2 牛支原体PCR检测电泳图

综合上述结果，从60份鼻拭子中共检测出19份牛支原体，检出率为31.67%（19/60）；同时从60份中鼻拭子中分离出2份，分离率为3.33%（2/60）。结果表明，PCR检出率高于支原体分离率。

3 讨论

本研究于2021年11月采集省外引购的肉牛鼻拭子60份，从60份鼻拭子中共检测出19份牛支原体，检出率为31.67%（19/60）；同时从60份中鼻拭子中分离出2份，分离率为3.33%（2/60）。研究结果表明，PCR检出率高于支原体的分离率。究其原因，第一，支原体培养条件要求比较苛刻，其培养基需要含丰富的血清蛋白、胆固醇和酵母浸液等成分，其中，血清主要提供胆固醇、脂肪酸和蛋白质，酵母浸液提供核苷前体、维生素及刺激生长的某些成分；第二，支原体没有细胞壁，稳定性较差[3]。因此，支原体分离难度较大、时间较长，一般不作为牛支原体的快速诊断方法。

目前，牛支原体已遍布全球，成为危害牛产业的病原之一[10]。该场牛支原体的发生主要是受到长途运输应激和环境应激导致的。2021年11月广西处在温热的环境，而北方已经处在寒冷天气，温度变化太大，再加上长时间的运输，更易导致牛只患病。有文献报道[3，11-12]，临床健康犊牛购入后1～7 d，鼻腔中可检出牛支原体，多数牛在运达目的地后1～2 周发病。更为严重的是，牛支原体常与化脓隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、牛呼吸道合胞体病毒等病原发生混合感染或继发感染，临床症状相似，难以鉴别，从而使病情更加复杂，治疗难度加大。因此，需要借助分子生物学方法鉴别。

目前还没研制出有效预防牛支原体感染的疫苗，该病的控制主要是依赖于良好的生产管理配合病原检测和有效的抗生素治疗。首先，养殖场应坚持自繁自育、全进全出的养殖模式，避免引种带来的疾病问题；其次，构建完善的管理方案，加强饲养管理，提高引进牛只自身抵抗力，降低运输对机体的应激；再次，做好常规疫苗免疫接种工作，保证牛抗体水平达标，保证牛养殖安全。