基于网络药理学的佩兰干预2型糖尿病作用机制研究※

李光美,张 婷,赵 伟

(1.贵州中医药大学,贵州 贵阳 550002;2.贵州中医药大学第二附属医院,贵州 贵阳 550001)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种以高血糖、相对缺乏胰岛素、胰岛素抵抗等为主要特征的代谢性疾病,发病率较高,已成为我国公共卫生领域面临的主要问题。中医在治疗糖尿病及其并发症方面具有显著疗效。《素问·奇病论》曰:“此人必数食甘美而多肥也……转为消渴,治之以兰,除陈气也。”该论述主张运用芳香化浊之佩兰治疗糖尿病。佩兰具有芳香化湿、醒脾开胃、发表解暑的功效,尤善治脾经湿热。相关研究表明,佩兰可下调T2DM大鼠肝脏中DGAT 2基因与蛋白表达,改善脂代谢紊乱[1-2],同时,佩兰的主要成分香芹酚可减轻T2DM患者的内皮细胞功能障碍和血管炎症[3]。但佩兰治疗T2DM的更多活性成分、作用靶点及通路尚有待探究。“浊毒”是指体内痰饮、水湿、瘀血不能及时排出而壅积化生的病理产物,又是损伤人体脏腑经络及气血阴阳的致病因素[4],浊毒为患被认为是糖尿病及其并发症的核心所在[5]。网络药理学可以从活性成分-靶点、靶点蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析及基因本体(gene ontology,GO)、京都基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析等进行直观、全面、系统地阐述药物与疾病的潜在关系。本研究主要基于网络药理学方法探讨佩兰干预2型糖尿病的作用机制,以期为后期临床研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 佩兰活性成分、靶点检索及筛选与“活性成分-靶点”网络图的构建 以佩兰为关键词,从TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中获取药物活性成分。将口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、药物相似性(drug likeness,DL)≥0.18作为筛选条件[6],从而得到目标活性成分及蛋白靶点,并在Uni-Prot数据库(https://www.uniprot.org)标准化蛋白质靶点信息。再将其筛选出的活性成分和标准靶点导入Cytoscape 3.7.2版软件,构建“活性成分-靶点”网络图。

1.2 T2DM的疾病靶标获取及交集靶点的获取 通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、DrugBank数据库(https://go.drugbank.com),搜索关键词为“Diabetes Mellitus”或“Diabetes”,筛选关键词为“TypeⅡDiabetes mellitus”或“TypeⅡdibetes”,得出T2DM的疾病靶点,并将其与筛选得到的佩兰靶点通过韦恩图(Draw Venn Diagram)得到交集靶点。

1.3 构建“药物-疾病”蛋白互作PPI图 将佩兰干预T2DM的蛋白靶点导入STRING数据库平台(https://www.string-db.org)构建PPI网络图,再将所得数据导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理分析,以度值(degree)和连接评分(combined score)分析靶点之间相互的作用关系。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析 运用Metascape(https://metascape.org/gp/index.html/main/step1)对筛选得到的佩兰干预T2DM的潜在蛋白靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,以P＜0.01作为筛选条件,对富集的通路和GO功能排序,运用微生信在线(http://www.bioinformatics.com.cn)及Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理,并构建佩兰干预T2DM的关键靶点及信号通路网络图,进一步阐述蛋白靶点与通路的相关性。

2 结果

2.1 佩兰活性成分及靶点筛选结果 通过TCMSP数据库共获得60个佩兰的已知成分,以OB≥30%和DL≥0.18作为筛选条件获得11个活性成分,剔除在TCMSP数据库未找到相关蛋白靶点的4个成分,共纳入佩兰的7个活性成分(见表1),再将其通过TCMSP数据库得到相应靶点名称,去重后得到87个蛋白靶点,将其蛋白靶点名称输入UniProt数据库,获得其标准化蛋白靶点名称共79个。

表1 佩兰活性成分

2.2 药物“活性成分-靶点”网络图的构建 将佩兰的活性成分与蛋白靶点通过Cytoscape 3.7.2软件构建网络图,网络图共包含86个节点(7个活性成分和79个靶点)和101条线,其中菱形节点代表活性成分,正六边形节点代表蛋白靶点,线代表活性成分与蛋白靶点的关系,其中活性成分与degree和节点(betweenness)呈正相关[7]。结果显示,木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、泽兰苦素(Eupatoriopicrin)等在网络图中具有枢纽作用,这可能是佩兰干预T2DM的关键活性成分。见图1。

图1 佩兰干预2型糖尿病药物活性成分靶点图

2.3 获取T2DM的疾病靶标及“药物-疾病”交集靶标 通过Genecards数据库获取T2DM靶点,以Relevance score≥24.2作为标准,获得1 209个蛋白靶点。分别将佩兰与T2DM的蛋白靶点导入韦恩图后得到45个交集靶点。见表2。

表2 佩兰干预2型糖尿病的有效靶点

2.4 “药物-疾病蛋白互作”PPI图 将二者交集蛋白靶点导入STRING在线数据库,限定物种为“Homo sapiens”,选取相互作用阈值高于0.9的高置信度数据,隐藏无蛋白互作关系的靶点[8]后得到37个节点、114条边、平均节点度数为5.07的蛋白互作PPI网络图。继将其导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理分析,以degree值和combined score值分析靶点之间相互的作用关系。节点的形状大小代表degree值,圆形越大,degree值越高,反之越低;节点之间连线的粗细代表combined score值,线条越粗,互作分数越高,反之越低,以此筛选出网络中信息传递效率更高、影响作用更大的核心靶点。结果显示AKT1(protein kinase B)、TP53(tumor suppressor p53)、JUN(Jun Proto-Oncogene)、IL6(Interleukin 6)、TNF(Tumor Necrosis Factor)、VEGFA(vascular endothelial growth factor A)、MAPK1(mitogen-activated protein kinase 1)为其核心靶点。见图2。

图2 佩兰干预2型糖尿病核心蛋白靶点PPI网络图

2.5 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析运用Metascape数据库对佩兰干预T2DM的45个靶点进行GO功能和KEGG信号通路富集分析。GO分析得到1 290个GO条目(P＜0.01),其中生物过程(biological process,BP)1 187个,细胞组成(cellular component,CC)46个,分子功能(molecular function,MF)57个,将三者可信度前10的条目运用微生信在线进行可视化处理(见图3),结果主要涉及氧化应激反应、细胞凋亡通路等生物过程。KEGG通路富集分析获得242条通路(P＜0.01),筛选出可信度前18的信号通路,利用微生信在线进行可视化处理(图4),主要涉及癌症通路(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、白细胞介素-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、胰岛素抵抗信号通路(insulin resistance)、AGE/RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic)等。并将筛选出的信号通路利用Cytoscape3.7.2软件进行可视化处理,得出靶点-通路网络图。见图5。

图3 佩兰干预2型糖尿病核心靶点GO富集分析图

图4 核心靶点KEGG通路富集分析

图5 靶点-通路网络图

3 讨论

3.1 佩兰治疗T2DM的有效成分分析 本研究采用网络药理学方法预测佩兰干预T2DM的主要活性成分及蛋白靶点。根据药物活性成分靶点图可知,木犀草素作为佩兰的主要活性成分,可能在干预T2DM的方面发挥重要作用。木犀草素是一种黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎和神经保护活性。目前认为代谢性炎症与T2DM密切相关,是T2DM的一个关键组成部分,可导致胰岛素抵抗[9]。研究发现,木犀草素够明显改善早期糖尿病大鼠心功能,减少心室肥大[10],在治疗T2DM血管内皮及血管功能障碍中发挥抗炎作用[11],并减轻糖尿病大鼠的氧化应激反应和胆碱酯酶活性,改善神经元损伤和认知能力[12]。基于以上研究,可见木犀草素在治疗T2DM及其并发症方面疗效显著,可能与其抑制代谢炎症作用有关,这也与本研究筛选出的佩兰干预T2DM的活性成分吻合。

3.2 佩兰治疗T2DM的有效靶点分析 从PPI图可知,AKT1、TP53、IL6、TNF等作为核心靶点可能在佩兰干预T2DM过程中发挥重要作用。AKT也被称为蛋白激酶B,对细胞迁移和生长的调控至关重要,AKT1作为AKT的一种亚型在人体中广泛表达,主要通过磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)和m TOR复合物2(m TORC2)被激活[13-15]。研究发现AKT可直接抑制Fox01,而降低体内葡萄糖水平[16]。肿瘤抑制基因TP53位于17号染色体上,TP53的多态性已成为癌症研究的热点,同时也有研究证实了TP53中的rs1042522与T2DM的风险有显著的相关性[17]。IL-6在炎性反应中处于重要地位,IL6R是miR-22的靶基因,通过JAK/STAT信号通路的miR-22调控,抑制T2DM胰岛β细胞的存活和凋亡[18]。TNF为肿瘤坏死因子,其作为炎性反应的核心因子参与了糖尿病发生发展的过程,TNF-α的表达与空腹血糖水平呈显著正相关[19],抑制TNF-α的表达使胰岛素敏感性增加,过度表达则诱发胰岛素抵抗[20]。以上研究表明,本研究筛选出的佩兰治疗T2DM的蛋白靶点多与细胞凋亡、炎性反应相关。胰岛β细胞分泌缺乏、功能下降甚至细胞凋亡是T2DM发生发展的关键原因,根据本研究的预测,佩兰可能通过抑制胰岛细胞凋亡,抑制炎症因子释放而治疗T2DM。

3.3 佩兰治疗T2DM的GO富集分析及KEGG通路分析 根据靶点-通路网络图可知,PI3 K-Akt信号通路、AGE/RAGE信号通路、IL-17信号通路、胰岛素抵抗信号通路等与T2DM密切相关。PI3K/AKT信号通路是胰岛素代谢的主要途径,该通路增加葡萄糖利用并减少肝脏和肌肉中的糖异生,进而调节脂质和葡萄糖代谢平衡[21-23],并在T2DM高血糖症、神经退行性变,以及动脉粥样硬化斑块病理性新血管的形成和发展中起到抑制作用[24]。AGE/RAGE信号通路在高血糖和钙化条件下,可以通过PKC、p38 MAPK、fetuin-A、TGF-β、NF-κB 和 ERK1/2 信 号 通路极大影响细胞和全身对增加骨基质蛋白的反应,并通过激活Nox-1和降低SOD-1的表达来增加氧化应激以促进糖尿病介导的血管钙化[25],是糖尿病周围神经病变及糖尿病肾病发病的重要机制[26]。IL-17信号通路是一种参与免疫反应的细胞因子,研究发现,IL-17与纤维化相关的糖尿病性心肌病相关[27],且IL-17信号通路可能是种植体周围炎和T2DM病之间的主要分子机制[28]。胰岛素抵抗信号通路蛋白包括PI3K/Akt、PKC、MAPK、AMPK、NF-κB等[29]。李建萍等[30]初步发现丹参-红花配伍对于胰岛素信号通路中代谢调控途径和有丝分裂调控途径的稳态失衡具有显著的调控作用。基于以上论述,佩兰作用于多条通路对T2DM发挥干预作用,但具体机制还有待深入研究。

4 小结

本研究采用网络药理学方法对佩兰干预T2DM的复杂机制作了简单探索,得出了佩兰干预T2DM的主要活性成分、蛋白靶点及相关通路多与细胞凋亡、炎症因子相关,为探索芳香化浊药物对T2DM的干预作用作了基础铺垫。结合本项目组前期研究成果,以佩兰为君药的中药复方“浊毒清”有效治疗T2DM及其并发症[31-34]。临床研究表明,浊毒清改善胰岛素抵抗的机制与其抗炎作用有关,浊毒清可通过降低炎症因子水平、抑制代谢性炎性反应进而改善胰岛素抵抗[35],但其发挥作用的主要活性成分及作用通路还有待研究,后续将在本研究的基础上,提取相关活性成分,探讨佩兰干预T2DM的具体作用机制,为临床运用佩兰提供更多的理论基础。