沙利度胺灌胃对烟雾暴露致大鼠肺间质纤维化合并肺气肿的影响及其机制

魏会强，郭丽萍，侯彦琨，郝秀玲，马志敏，柴永娜

1河北医科大学第二医院呼吸内科，石家庄 050060；

2河北医科大学第二医院中西医结合心血管内科

肺间质纤维化合并肺气肿（CPFE）是一种吸烟相关的间质性肺疾病，属于肺纤维化的一种特殊表型，CT影像表现为双上叶肺气肿和双下叶肺纤维化［1］。一般认为，肺气肿和肺纤维化在临床上是两种不相关的疾病，但随着胸部高分辨CT的应用，发现许多吸烟患者同时伴有肺间质纤维化和肺气肿的影像改变，因此烟雾暴露是导致CPFE的主要危险因素［2］。目前，临床通常使用激素及免疫抑制剂治疗CPFE。氢化可的松是从肾上腺皮质中提取出的对糖类代谢具有较强作用的糖皮质激素，是临床治疗CPFE的常用药物，疗效确切。但长期应用糖皮质激素可能引发较严重的不良反应，如肺部或机体其他部位发生细菌或真菌感染等。沙利度胺是一种谷氨酸衍生物，具有免疫抑制及抗血管生成等作用，近年来常被用于抗肿瘤治疗，而关于其在CPFE中的治疗作用鲜有报道。2020年7月—2021年12月，本研究通过烟雾暴露诱导小鼠CPFE，观察沙利度胺在此过程中对CPFE的改善作用并分析其机制，希望可以为临床治疗CPFE提供新的治疗方向及相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料雄性SD大鼠120只，体质量（210±10）g，购自河北医科大学实验动物中心。沙利度胺溶液购自常州制药有限公司，转化生长因子β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA检测试剂盒购自上海巧伊生物技术有限公司。

1.2 动物分组与处理将SD大鼠随机分为对照组、烟雾暴露组、沙利度胺组、阳性药物对照组各30只。烟雾暴露组、沙利度胺组、阳性药物对照组分别置于自制的40 cm×50 cm×60 cm的有机玻璃容器内，容器内放入香烟进行烟雾暴露（5支/次，2次/天），每次暴露在烟雾中的时间为1 h，共暴露30 d。沙利度胺组于烟雾暴露第1天用1%沙利度胺溶液（100 mg/kg）灌胃，每天1次；阳性对照组于烟雾暴露第1天腹腔内注射氢化可的松（80 mg/kg），每天1次。对照组置于相同容器内，呼吸新鲜空气。各组大鼠均给予普通饲料喂养，自由饮水。

1.3 肺组织病理观察采用HE染色及Masson染色。于烟雾暴露第7、15、30天，分别取10只各组大鼠（沙利度胺组大鼠分别于烟雾暴露第5天及第17天各死亡2只）腹腔内灌注麻醉药物戊巴比妥钠（50 mg/kg），通过股动脉放血的方式处死，放血初收集血液待检，处死后快速开胸，取出右肺上叶及下叶，用4%多聚甲醛溶液固定，制成石蜡切片。HE染色：将制作好的石蜡切片脱蜡、透明、脱水，苏木素染色，盐酸乙醇分化，伊红染色，脱水、脱蜡液透明、中性树胶封片，显微镜观察。Masson染色：将制作好的石蜡切片脱蜡、透明、脱水，苏木素染色，酸性乙醇分化液分化，Masson蓝化液返蓝，品红染液染色，苯胺蓝液或绿液复染，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜观察。

1.4 血清TGF-β1、VEGF和TNF-α水平检测采用ELISA法。将从股动脉收集的各组大鼠血液标本在室温凝固30 min后，3 000 r/min离心15 min，取上清液分装于试管内，于-80℃冰箱内保存。取各组-80℃冰箱保存的血清，按照ELISA试剂盒说明书检测血清TGF-β1、VEGF和TNF-α水平。

1.5 统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料通过Sample K-S进行正态检验，符合正态分布的以±s表示，组间比较行t检验，多组间比较行方差分析，不同时点测量数据比较行重复测量的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理学变化比较

2.1.1 HE染色对照组大鼠肺泡腔结构正常，肺泡腔内无明显炎症及纤维化的呈现。烟雾暴露组大鼠在第7天时病变部位肺泡扩张，肺泡间隔变窄，以上肺为甚，中下肺部分肺泡萎缩，肺泡间隔变厚，毛细血管再生明显，呈簇状聚集，肺泡间隔显著增宽，肺泡内可见红细胞及炎症细胞，其中炎症细胞以巨噬细胞和淋巴细胞为甚，同时伴大量成纤维细胞渗出；第15天时可见炎症细胞减少，肺泡炎症缓解，上叶部分肺泡持续扩张有融合趋势，扩张肺泡可溶解成囊肿，下叶肺泡壁较前明显增厚，成纤维细胞分化明显，成纤维细胞大量增多，部分肺泡结构逐渐消失，形成了更多的新毛细血管；第30天时可见肺大疮与肺间质纤维化交替存在，不过仍以上肺肺大疮、下肺纤维化为甚，有局部淋巴细胞渗出，但炎症反应匮乏，血管缺如。沙利度胺组及阳性药物对照组在各时点肺组织病理改变与烟雾暴露组大体相同，但肺泡炎症、纤维化及肺大疮程度明显减轻。见OSID码图1～3。

2.1.2 Masson染色对照组大鼠右下肺组织中细胞外基质出现少许胶原纤维被染成蓝色。烟雾暴露组在第7天时出现肺泡上皮损伤和上皮下基底膜破坏，成纤维细胞聚集，胶原蛋白沉积致纤维化，中、下肺部出现胶原纤维，可见少量染成蓝色的胶原纤维；第15天时肺泡壁厚度增加，成纤维细胞聚集，部分肺泡结构逐渐消失，形成纤维化及大量瘢痕组织，可见大量染蓝的胶原纤维；30天时上肺大疮较前变化不大，下肺可见大量肺泡壁破坏融合，呈蜂窝改变，可见大量密集的蓝色胶原纤维。与烟雾暴露组比较，沙利度胺组和阳性药物对照组胶原含量均减少，肺大疮严重程度减低。见OSID码图4～6。

2.2 各组大鼠不同时点血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比较各组大鼠同时点血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比较，烟雾暴露组＞阳性药物对照组、沙利度胺组＞对照组（P均＜0.05），沙利度胺组与阳性药物对照组同时点TGF-β1、VEGF、TNF-α水平差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠不同时点血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

表1 各组大鼠不同时点血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

注：与对照组同时点比较，△P＜0.05；与模型组同时点比较，*P＜0.05。

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3 讨论

目前，CPFE的发病机制仍不明确，临床观察到CPFE常发于男性，且多数有吸烟史。大量临床研究显示，吸烟与肺气肿及肺间质纤维化的发病相关，是肺气肿及肺间质纤维化的共同危险因素。临床上可见，有吸烟史的患者可同时出现肺气肿和肺间质纤维化的病理变化，其上肺主要表现为小叶中心性肺气肿，下肺以寻常型间质性肺炎为主要类型。烟雾吸入可趋化炎症细菌入侵肺内，并产生一定的炎症反应，损害肺泡组织，这在一方面可引起肺气肿，另一方面又可能引发肺部间质纤维化早期的炎症反应而产生纤维化［2］。本研究通过将大鼠暴露于烟雾之中诱导小鼠CPFE，经肺组织HE染色及Masson染色可见烟雾暴露组大鼠存在肺大疮及肺纤维化，提示CPFE诱导成功。目前，激素及免疫抑制剂是临床常用的CPFE的治疗药物。在肺气肿及肺纤维化形成的过程中，会产生大量炎症因子及介质，激素及免疫抑制剂在理论上均能抑制炎症进一步加重，从而阻断病情恶化。本研究在诱导大鼠CPFE的过程中，分别用氢化可的松及沙利度胺干预，通过观察肺组织病理学变化可见，与烟雾暴露组比较，阳性药物对照组及沙利度胺组肺部炎症及肺大泡、肺纤维化程度明显减轻；但阳性药物对照组与沙利度胺组比较病理缓解程度无明显差异，提示氢化可的松及沙利度胺均可改善烟雾暴露诱导的小鼠CPFE。

肺泡巨噬细胞、单核细胞、肺成纤维细胞等多种细胞均能产生许多炎症因子，这些炎症因子在CPFE发生中起重要作用。研究显示，TNF-α与肺间质纤维化有着密切的关系，参与了纤维化的病理过程［3］。纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）是一种单链糖蛋白，DING等［4］研究发现，PAI-1能够与TNF-α、TGFβ1等相互作用，促进肺纤维化进程。由上可见，TNF-α、TGF-β1在肺间质纤维化形成中有着关键作用。有研究发现，吸烟肺气肿患者早期血浆VEGF水平较不抽烟的正常人升高，而晚期则较不抽烟的正常人下降，提示VEGF与肺气肿严重程度及烟雾暴露相关［5］。另外，VEGF对肺基质玻璃纤维化的发生发展亦有影响。研究显示，新生血管再生及聚集在肺纤维化形成中起着关键作用，而VEGF信号途径在新生血管形成中起着重要的调控作用，因此也参与了纤维化的形成［6-7］。因此，TGF-β1、VEGF、TNF-α均与肺气肿及肺间质纤维化有着密切的关系。本研究结果显示，与对照组比较，烟雾暴露组血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平均显著升高，提示烟雾作为肺气肿、肺间质纤维化形成的危险因素，可能通过影响以上三种因子的变化来诱导CPFE。

血管内皮细胞因子具有增加血管通透性、促进血管内皮细胞增殖等作用，与多种疾病的发生发展密切相关［8］。有学者发现，应用血管内皮细胞因子受体拮抗剂可诱导肺泡隔毛细血管内皮细胞凋亡，进而形成肺气肿［9］。目前，CPFE尚无明确的治疗手段，临床中一般认为免疫抑制剂及激素疗效相对肯定［10-11］。在20世纪50年代，沙利度胺作为一种镇静药物进入市场，但后来因其严重的致畸形作用几乎被全球禁用。然而，沙利度胺的作用并未被全盘否定，随着对沙利度胺临床应用的深入研究，发现沙利度胺有很多积极的临床作用，特别是在免疫、抗炎、抗血管生成中取得了令人鼓舞的结果。ZHAO等［12］及YE等［13］通过对动物模型及临床纤维化患者的相关研究发现，沙利度胺对肺间质纤维化有抑制作用。此外，多项研究表明，沙利度胺可通过下调TNF-α及TGF-β等炎症细胞因子水平来减轻肺纤维化程度，进而抑制纤维化［14-15］。糖皮质激素治疗肺间质纤维化及肺气肿的疗效已在临床中相对肯定，尤其是对肺气肿疗效更加可靠，但治疗机制仍不是完全明确［16］。有些专家认为，抑制炎症反应为主要途径，本研究使用氢化可的松及沙利度胺干预烟雾暴露诱导的CPFE并观察血清中TGF-β1、VEGF、TNF-α水平，发现阳性药物对照组及沙利度胺组血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平与烟雾暴露组比较下降明显，提示沙利度胺及氢化可的松可能通过抑制TGF-β1、VEGF、TNF-α的表达改善CPFE的肺组织病理，缓解CPFE进展。

综上所述，沙利度胺灌胃可减轻烟雾暴露所致大鼠CPFE，其机制可能与抑制TGF-β1、VEGF、TNF-α水平，减轻炎症反应及抑制新生血管生成有关。本研究结果表明，沙利度胺及氢化可的松均可改善CPFE病理的恶化，但未对两者联合应用的效果进行观察。有研究显示，单独应用糖皮质激素治疗肺间质纤维化及肺气肿效果不佳［17］。另有研究表明，激素联合其他药物治疗能明显缓解CPFE患者临床症状，包括肺功能情况、血气状况等，提示联合治疗在临床症状改善上可能具有更好的效果［10，18］。沙利度胺因严重不良反应一度被放弃使用于临床，且其不良反应与剂量呈正相关。因此在临床应用沙利度胺治疗疾病时，一般都是联合其他药物应用，以减少沙利度胺的使用剂量，尽量避免其不良反应［19］。因此，我们拟在后续的研究中探讨沙利度胺联合氢化可的松对CPFE的改善作用是否优于单药，以降低药物单独使用的不良反应，改善CPFE患者的预后，为临床治疗CPFE提供新的思路。