宫颈癌阴道灌洗液源外泌体差异表达miRNA筛选及其关键靶基因的生物信息学分析

吕单单，徐梦伟，王磊，木叶斯尔·买买提，林晨

1新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐8 300172；2新疆医科大学公共卫生学院

宫颈癌是发生在子宫阴道部及宫颈管的、女性生殖系统最常见的恶性肿瘤。随着医疗技术的发展，接受标准化治疗的宫颈癌患者5年生存率约为80%，但是一旦发生转移，其5年生存率将降至50%［1］。因此，宫颈癌的早期诊断和早期治疗尤为重要。阴道分泌物由宫颈腺体分泌物等成分组成，可以反应宫颈分泌物的改变，与血液比较，其临床上收集无创且方便，受其他系统影响较小，因此从阴道分泌物中寻找诊断、治疗、预后等分子标志物是目前的研究热点之一。外泌体是由多种细胞分泌的纳米级囊泡外小体，其可携带多种miRNA从供体细胞转移至受体细胞，在受体细胞中干扰基因表达，参与多种生物过程。2019年11月—12月，本研究通过超速离心法提取患者阴道灌洗液中的外泌体，分析宫颈癌患者阴道灌洗液源外泌体中差异表达的miRNA，并对差异表达miRNA序列对应基因组DNA序列进行靶位点预测，筛选出在宫颈癌中具有高度连通性的关键靶基因，以期为寻找宫颈癌的潜在生物标志物奠定实验基础。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料经新疆医科大学伦理委员会批准（审批号：XJYKDXR202208240102），选取于我院行手术治疗的宫颈癌患者及同期接受体检的宫颈炎志愿者。纳入标准：①宫颈癌患者：经组织病理学检查确诊为宫颈鳞状细胞癌且未接受手术、放疗或化疗等治疗；②宫颈炎患者：经组织病理学检查确诊为宫颈炎；③近期没有服用常规处方药或避孕药，没有献血及怀孕；④3个月内没有接种过疫苗；⑤患者及家属签署知情同意书。排除标准：①合并慢性、感染性、自身免疫性疾病；②合并遗传性疾病；③合并其他类型肿瘤。共选取符合标准的宫颈癌患者及宫颈炎患者各5例。

1.2 样本采集及外泌体提取采集宫颈癌患者及宫颈炎患者阴道灌洗液，采集完成后立即放入液氮中转移至-80℃冰箱保存。采用超速离心法提取外泌体。37℃水浴解冻样本，冰上放置；4℃2 000 r/min离心10 min，留取上清；4℃10 000 r/min离心30 min，取上清；样本转移至超高速离心管中，4℃110 000 r/min离心75 min，弃上清；用1 mL 1×PBS重悬沉淀，重悬后各用1×PBS稀释，0.22 μm膜过滤；样本转移至超高速离心管，4℃110 000 r/min离心75 min，弃上清；沉淀用相应的1×PBS重悬，分装，-80℃保存。

1.3 外泌体鉴定①形态观察：采用透射电镜（TEM）观察外泌体形态。取外泌体冻存样本，37℃水浴解冻。取10 μL滴于封口膜表面，夹取一片聚醋酸甲基乙烯—碳（Formvar-carbon）载样铜网，将铜网Formvar膜面朝下放在悬液上轻蘸取适量外泌体悬液。在干燥环境中让Formvar膜充分吸收5 min，使外泌体附着于Formvar膜表面。用0.75%二水合醋酸铀酰染色5 min，并在PBS中漂洗3次，轻轻夹取铜网，将多余水分用吸水纸上吸干，于电镜下观察摄片。②粒径大小：采用纳米颗粒追踪分析（NTA）鉴定外泌体粒径大小。外泌体样本水浴解冻后用PBS缓冲液稀释至颗粒浓度108～109/mL，用移液枪向检测槽注入1 mL稀释的外泌体溶液，使用Nano ZS90粒径仪进行检测并记录分析数据。

1.4 宫颈癌外泌体差异表达miRNA筛选取宫颈癌患者及宫颈炎患者阴道灌洗液提取的外泌体样本制作基因芯片（上海华盈生物医药科技有限公司）。对制作完成的基因芯片本身及芯片数据做质量控制，芯片扫描图上无物理划伤，芯片扫描图放大后能清晰显示。芯片阵列名以及角落的黑白棋盘状图案，表示B2 Oligo强阳性杂交质控合格（OSID码图1）。采用R语言进行宫颈癌外泌体差异表达miRNA分析，通过T-test计算得到P值。miRNA序列差异显著性标准按差异倍数＞2、组内样本数≥3时，P＜0.05进行筛选；进一步选出差异倍数前20的miRNA进行后续分析。

1.5 差异表达miRNA靶基因GO生物功能与KEGG通路富集分析通过mirtarBase数据库对宫颈癌外泌体差异表达miRNA进行靶基因预测。通过R语言的clusterProfiler包对靶基因进行GO生物功能、KEGG通路富集分析。以P＜0.05为差异有统计学意义，选择分析项目为生物过程、分子功能、细胞成分及信号通路。根据P值大小进行排序，筛选排名前40的生物过程及信号通路。

1.6 宫颈癌差异表达miRNA关键靶基因筛选运用STRING10.5（https：//string-db.org/）在线工具选择Multiple Proteins，物种选择Home sapiens，对差异表达miRNA靶基因进行蛋白质—蛋白质互相作用（PPI）网络分析。运用Cytoscap3.8.0中的cytohubba插件对PPI网络进行拓扑分析，筛选出排名前20的具有高度连通性的枢纽靶基因。采用R语言对枢纽靶基因进行KEGG信号通路富集分析，与差异表达miRNA靶基因富集的KEGG信号通路取交集，筛选出共有的关键信号通路及与之相联系的关键靶基因。

2 结果

2.1 外泌体鉴定结果TEM可观察到清晰的囊泡结构，呈双层囊膜、茶托型或一侧凹陷的半球形，为典型的外泌体形态。NTA显示，样本粒径大小均符合外泌体的粒径标准（30～190 nm）。见OSID码图2、3。

2.2 宫颈癌外泌体差异表达miRNA筛选结果宫颈癌阴道灌洗液源外泌体中显著差异表达的miRNA共有84个，其中上调71个、下调13个。差异倍数前20的miRNA中上调18个、下调2个。见表1。

表1 宫颈癌外泌体差异表达miRNA筛选结果

2.3 差异表达miRNA靶基因GO生物功能与KEGG通路富集分析结果通过mirtarBase数据库获得与差异表达miRNA相关的273个靶基因。GO生物功能分析显示，差异表达miRNA靶基因主要分布于细胞黏附斑、细胞—基质黏附结点、细胞—基质结点等，主要富集的生物过程为角蛋白结合、泛素样蛋白连接酶结合、泛素类蛋白连接酶结合等，主要富集的分子功能为核糖核蛋白复合物的生物生成、病毒基因表达、病毒转录等。KEGG信号通路分析显示，差异表达miRNA靶基因主要富集的信号通路为癌症中的蛋白聚糖、细胞衰老、神经营养素信号通路等。见OSID码图4、5。

2.4 宫颈癌差异表达miRNA关键靶基因筛选结果宫颈癌中具有高度连通性的枢纽靶基因分别为FGF2、PDGFRB、PIK3R1、NRAS、IGF1R、MAPK14、AGO1、ITGB3、BCL2L1、H2AFX、AGO4、TNRC6B、SOCS1、FRS2、TGFBR1、EDN1、THBS1、CDKN1B、BCL2L11、ZNF217。见OSID码 图6、7。宫颈癌关键信号通路为AMPK信号通路、mTOR信号通路、细胞凋亡、癌症中的蛋白聚糖、TNF信号通路、FoxO信号通路、PD-L1在肿瘤中的表达及PD-1检测点通路，关键基因为PIK3R1、EDN1、PDGFB、FGF2、IGF1R、THB1S、ITGB3、TGFBR1、NRAS、MAPK14。见表2。

表2 宫颈癌差异表达miRNA调控的关键信号通路及参与基因分析结果

3 讨论

宫颈癌发病率有明显的地区差异，新疆是宫颈癌高发地区，维吾尔族妇女宫颈癌的发病率居全国第一［2］。宫颈癌早期症状隐匿，许多患者发现症状就诊时已为癌症中晚期。因此，寻找新的宫颈癌生物标志物以对宫颈癌和癌前病变进行早期发现和治疗，对降低宫颈癌发病率及病死率十分重要。

作为液体活检领域“三大标杆”之一的外泌体，被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体。外泌体来源于细胞核内，由多囊泡体内陷腔化形成并通过多囊泡体与细胞膜融合而释放到细胞外环境中，广泛存在于血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液和乳液等多种体液中，主要通过与靶细胞的细胞膜融合以及胞吞作用等方式将其内的miRNA、mRNA、lncRNA及蛋白质等物质传递到靶细胞内，参与免疫应答、细胞迁移、肿瘤侵袭、抗原提呈等过程［3］。多项研究表明，细胞中的miRNA可以包装在外泌体中并释放，外泌体miRNA并非被动释放，而是在特定刺激下的选择性分泌［4-5］。WU等［6］研究发现，血浆源外泌体miR-30d-5p和let-7d-3p是宫颈癌及其前体无创筛查的有价值的诊断生物标志物。LIU等［7］发现，宫颈癌患者阴道灌洗液源外泌体中的miR-21和miR-146a上调。本研究发现，宫颈癌患者阴道灌洗液源外泌体中显著差异表达的miRNA共有84个，其中上调71个、下调13个，包括miR-320d、miR-320c、miR-24-3p、miR-191-5p、let-7d-5p、let-7a-5p、miR-23b-3p等。CAMPOS-VIGURI等［8］研究显示，miR-23b-3p是宫颈癌中的肿瘤抑制因子，并通过直接调节络氨酸激酶c-Met参与人宫颈癌细胞C33A及CaSki的增殖、迁移和侵袭的调节。另有研究发现，miR-320c能够通过靶向GABRP来抑制宫颈癌中的迁移潜能［9］。

我们进一步对宫颈癌中差异表达miRNA的靶基因进行GO生物过程及KEGG信号通路富集分析，发现这些靶基因涉及细胞生长、凋亡、黏附及连接以及炎症反应、巨噬细胞活化、蛋白质分解代谢等生物过程，并且能够通过癌症中的蛋白聚糖、细胞衰老、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路及NF-κB信号通路等影响宫颈癌的发生发展过程。这提示宫颈癌源外泌体能够通过参与炎症及免疫的调节，从而调控宫颈癌的发生发展。多项研究显示，外泌体在肿瘤性炎症微环境中起着关键作用［10-11］。使用STRING对差异表达miRNA靶基因进行PPI网络分析，筛选出宫颈癌中具与有高度连通性的关键靶基因，分别为FGF2、PDGFRB、PIK3R1、NRAS、IGF1R、MAPK14、AGO1、ITGB3、BCL2L1、H2AFX、AGO4、TNRC6B、SOCS1、FRS2、TGFBR1、EDN1、THBS1、CDKN1B、BCL2L11、ZNF217。有研究表明，半夏提取物能够通过抑制SOCS1和激活下游JAK2-STAT1/STAT4/STAT5通路，恢复人宫颈肿瘤浸润性树突状细胞受损的功能［12］。WANG等［13］研究表明，miR-92a在宫颈癌组织中表达上调，通过负调控PIK3R1促进宫颈癌恶性发展。

综上所述，我们采集宫颈癌及宫颈炎患者的阴道灌洗液，通过超速离心法提取其中外泌体，发现宫颈癌中miR-320d、miR-320c、miR-24-3p、miR-191-5p、let-7d-5p等miRNA存在显著差异表达，且PIK3R1、EDN1、PDGFB、FGF2、IGF1R、THB1S、ITGB3、TGFBR1、NRAS、MAPK14等靶基因在宫颈癌中具有关键作用，提示阴道分泌物外泌体miRNA作为宫颈癌无创性生物标志物的可能性。由于外泌体含有众多可以用来诊断疾病的分子载体，而且不需要常规活检，故其在液体活检方面有很大的前景。本研究采用超速离心法提取的外泌体中包含有非外泌体的囊泡，后续实验可结合分子尺寸排阻色谱法或免疫亲和捕获技术中的酶联免疫吸附测定进一步改进。尽管关于外泌体的收集、分离和鉴定存在一定的难度，且大多研究还停留在对细胞表型的探索上，但随着纳米颗粒追踪分析、免疫蛋白捕获和高通量测序等技术的快速发展，外泌体分离和鉴定的效率也将不断提高，其作为疾病的无创性新生物标志物也随之变为可能。未来可以通过大样本实时荧光定量PCR验证进一步证实外泌体中miRNA的差异表达情况，并构建差异miRNA抑制和过表达的载体，寻找其细胞表型变化及相关信号通路，为进一步探寻宫颈癌的分子标志物提供新思路。