高效液相色谱法测定奥氮平双羟萘酸盐一水合物中二甲基亚砜和二甲基甲酰胺的残留量

王锦，周三云，曹婉，高喜乐，王艳娟，李龙英（浙江圣兆药物科技股份有限公司，杭州 310051）

精神分裂症因其特殊性需长期治疗，目前给药依从性差是精神分裂症长期治疗的主要问题，礼来制药公司将活性成分奥氮平和双羟萘酸结合生成一种难溶性化合物（奥氮平双羟萘酸盐一水合物），该难溶性化合物在注入肌肉后形成药物储库，持续缓慢地释放奥氮平，以达到延长给药周期的目的，解决了依从性差的问题，具有临床优势[1]，目前已在欧洲（商品名：Zypadhera）和美国（商品名：Zyprexa Relprevv）上市[2]。

原料药奥氮平双羟萘酸盐一水合物仅收录于欧洲药典[3]，《中国药典》尚未收载。目前合成该原料药的工艺溶剂主要有二甲基亚砜（DMSO）和二甲基甲酰胺（DMF），因二者的沸点较高，生产工艺中通过水洗较难去除完全，《中国药典》2020年版四部通则中0861 残留溶剂测定法[4]和ICH Q3C（R5）均将DMSO 和DMF 分别列为第三类溶剂和第二类溶剂，限度依次为0.5%、0.088%。本文根据公司实际使用需要，将原料药奥氮平双羟萘酸盐一水合物中DMSO 限度收严至0.3%。目前有多篇文献报道了DMF 或DMSO残留量的检测方法，均采用气相色谱法[5-10]。奥氮平双羟萘酸盐一水合物熔点高达210℃且熔融分解，极易污染气相色谱柱，气相直接进样不适用于该品种；而DMSO 和DMF 沸点较高，顶空进样同样不适用；DMSO 与DMF 沸点极性相近，气相色谱较难实现两者的完全分离，已报道文献不能同时检出这两种组分。另有文献报道了水和废水中的DMF、DMAC、DMSO 的HPLC 分析方法[11]，但因水和废水与奥氮平双羟萘酸盐一水合物性质差异较大，该文献方法中的样品处理及色谱系统均不适用于奥氮平双羟萘酸盐一水合物中DMSO 和DMF 的检测，目前尚未见奥氮平双羟萘酸盐一水合物中DMSO 和DMF 残留量检测方法的文献报道。本文建立了一种测定奥氮平双羟萘酸盐一水合物中DMSO 和DMF 残留量的高效液相色谱方法，完成了方法学验证，该方法专属性好，简便灵敏，准确，具有较好的参考价值和现实意义。

1 材料

WATERS Arc 高效液相色谱仪（配有紫外检测器，美国Waters 公司）；MSA225S-1CE-DA 电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

奥氮平双羟萘酸盐一水合物（浙江圣兆药物科技股份有限公司，批号分别为P-3M、P-4M、P-5M）；正己胺、甲醇（色谱级，TEDIA）；DMSO[色谱级，GC 测定纯度≥99.9%，阿拉丁试剂（上海）有限公司]；DMF（色谱级，HPLC 测定纯度≥99.9%，TEDIA）；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse RX C8（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；紫外检测器；波长：210 nm；流速：0.75 mL·min－1；进样量：10 μL；流动相：水（A）和甲醇（B），梯度洗脱（0 ～8 min，10%B，8 ～15 min，10%B →90%B，15 ～20 min，90%B，20 ～20.1 min，90%B →10%B，20.1 ～30 min，10%B）。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品储备液 取DMSO 约1500 mg、DMF 约440 mg，精密称定，置于100 mL 量瓶内，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密移取上述溶液1 mL，置于50 mL 量瓶内，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL 中含DMSO、DMF 约300 μg、88 μg 的对照品储备液。

2.2.2 对照品溶液 精密移取对照品储备液1 mL，置20 mL 量瓶中，用5%正己胺甲醇溶液（以下简称稀释剂）稀释至刻度，得到每1 mL 中含DMSO、DMF 约15 μg、4.4 μg 的对照品溶液。

2.2.3 样品溶液 准确称取适量样品，加稀释剂溶解并稀释制成每1 mL 中含样品约5 mg 的溶液。

2.3 系统适用性试验

依次取稀释剂进样1 次、对照品溶液连续进样6 次，记录色谱图，结果稀释剂在DMSO 和DMF保留时间处均无干扰峰，DMSO 峰面积和DMF 峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.5%和1.0%，DMSO 峰和DMF 峰的分离度均大于1.5，证明该方法系统适用性良好。

2.4 专属性试验

依次取稀释剂、对照品溶液及样品溶液分别进样，记录色谱图。结果表明，溶剂及样品溶液在DMSO 和DMF 保留时间处均无干扰，各组分分离良好，方法专属性好，见图1。

图1 专属性试验色谱图Fig 1 Chromatograms of specificity test

2.5 检测限和定量限

精密量取对照品溶液用稀释剂稀释制成系列浓度溶液，取上述系列浓度溶液10 μL 注入色谱仪，当DMSO 和DMF 信噪比（S/N）为10 时，计算DMSO 和DMF 的定量限分别为15.284 ng 和8.842 ng。取定量限溶液，连续进样6 针，DMSO和DMF 峰面积RSD分别为1.3%、0.70%。

当DMSO 和DMF 的信噪比（S/N）为3 时，计算DMSO 和DMF 的检测限分别为4.58 ng 和2.65 ng。

2.6 线性关系考察

分别量取对照品储备液适量，用稀释剂稀释制成DMSO 质量浓度为1.517、3.035、7.587、15.174、22.760、30.347、37.934 mg·L－1，DMF 质量浓度为0.882、2.206、4.412、6.618、8.824 mg·L－1的系列混合对照品溶液。分别进样分析，记录色谱图。以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X（mg·L－1）为横坐标，进行线性回归。

得DMSO 线性方程：Y＝9.243×103X－652.5，相关系数为0.9996，表明DMSO 在1.517 ～37.934 mg·L－1内，峰面积与质量浓度线性关系良好。DMF 线性方程：Y＝4.964×104X－2.092×103，相关系数为0.9998；表明DMF 在0.882 ～8.824 mg·L－1内，峰面积与质量浓度线性关系良好。

2.7 回收试验

分别量取对照品储备液适量，用稀释剂稀释制成DMSO 质量浓度为1.527、7.634、15.084、30.347 mg·L－1，DMF 质量浓度为0.0824、2.206、4.412、5.295 mg·L－1的系列混合对照品溶液。精密称取12 份已测定DMSO 和DMF 残留量的样品约50 mg，每组3 份，用上述系列混合对照品溶液定容至10 mL。进样，记录色谱图，计算DMSO、DMF 回收率。结果不同质量浓度DMSO 的平均回收率在95.2%～119.4%，RSD在0.28%～2.2%；不同质量浓度DMF 的平均回收率在97.6% ～99.5%，RSD在0.31% ～1.4%。表明该方法下DMSO 和DMF 的回收率良好。

2.8 重复性试验

取奥氮平双羟萘酸盐一水合物6 份，按照“2.2.3”项下方法配制后进样测定，DMSO 和DMF含量分别为0.0754%和0.0038%，RSD分别为1.2%和8.2%，结果表明方法重复性好。

2.9 耐用性考察

考察了流速为0.65 mL·min－1和0.85 mL·min－1，柱温为33℃和37℃，起始流动相中有机相比例为8%和12%下的系统适用性，结果在上述各条件下，连续进样6 针对照品溶液的DMSO、DMF 峰面积RSD均小于5%，DMSO 和DMF 理论塔板数均大于2000，拖尾因子均小于2.0，各色谱峰间的分离度均大于1.5，结果表明方法耐用性良好。

2.10 溶液稳定性

取对照品溶液，于室温下放置，分别在0、24、55 h 进样测定，记录各组分的峰面积，计算DMSO 和DMF 峰面积RSD分别为1.0%、0.68%，表明对照品溶液在室温下放置55 h 内稳定。

2.11 样品的测定

取3 批奥氮平双羟萘酸盐一水合物，按“2.2.3”项下方法配制测试，结果见表1。

表1 样品检测结果Tab 1 Content of sample

3 结论

本文建立了同时测定难溶性药物奥氮平双羟萘酸盐一水合物中DMSO 和DMF 残留量的高效液相色谱法，该方法可实现DMSO 和DMF 的完全分离，且样品处理简单，所需样品量少，对色谱系统、色谱柱无损害，操作方便，准确度和重复性好，可实现奥氮平双羟萘酸盐一水合物中DMSO 和DMF 残留量的准确定量，为其他药物中高沸点残留溶剂的测定提供了思路和参考。