禽呼肠孤病毒基因组结构和功能及其基因工程疫苗的研究进展

刘媛，陈云娇 综述，王学理 审校

内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古 通辽 028042

上世纪50年代，在南非发现有番鸭患禽呼肠孤病毒病，1954年，Crawley 和 Fahey 首次从患有慢性呼吸道疾病的雏鸡呼吸道内分离出禽呼肠孤病毒（avian reovirus，ARV）。此后，荷兰、日本、意大利、匈牙利等国家也先后报道了该病。1985年，王锡堃等也在我国报道了鸡的呼肠孤病毒病。随后，该病在山东、河南、广西等地陆续被报道［1］。目前，禽呼肠孤病毒病所表现的症状越来越多样化，在防控方面的困难也逐渐加大。

近年来，随着我国畜牧业产业结构的调整，养禽业呈现集约化、规模化发展趋势，与此同时，禽病发生的种类、范围、病因等也发生了很大变化。新型呼肠孤病毒病主要以禽的肝脏发生不规则坏死或出现出血斑、出血点，心肌、腔上囊出血为主要特征［2］。呼肠孤病毒病感染谱和病理损害的变化对养禽业的发展存在巨大的威胁［3］。本文对ARV 的基因组结构和功能，以及其基因工程疫苗的研究进展作一综述，以期为禽呼肠孤病毒病的研究和防控提供参考。

1 基因组结构

ARV 为呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属，不含囊膜的线性双股 RNA（dsRNA）病毒［4-5］，其病毒粒子呈球形且为20 面体对称结构，直径约70 ～80 nm。成熟的ARV 为含有外层衣壳和内层衣壳的病毒粒子［6］。ARV 是由 10个双链的 RNA 片段组成，这些基因片段可分为 3 组，即 L、M 和 S 类。L 类 RNA包括 3个基因片段：L1、L2、L3；M 类 RNA 包括 3个基因片段：M1、M2、M3；S 类 RNA 包括 4个基因片段：S1、S2、S3、S4［7-8］。ARV 的 10个 dsRNA 基因片段可编码12 种蛋白，包括参与构成病毒粒子的结构蛋白λA、λB、λC、μA、μB、σA、σB、σC 和不构成成熟粒子的非结构蛋白 μNS、p10、p17、σNS［9］。

ARV 具有较强的稳定性，在4 ℃条件下可保存3年，37 ℃条件下可保存 15 ～ 16 周，60 ℃条件下可保存8 ～10 h。ARV 对氯仿、乙醚等均不敏感，对多种禽类的红细胞缺乏凝集特性。

2 ARV 蛋白结构及功能

L 类基因的 L1、L2、L3 片段分别编码 λA、λB、λC 蛋白［10］。XU 等［11］研究发现，ARV 的 L1 基因全长3 958 nt，该基因编码含有1 293 aa 的λA 结构蛋白；L2 基因编码的λB 蛋白全长1 259 aa，相对分子质量约140 ku；L3 基因由3 907 nt 组成，其编码的λC 蛋白由 1 285 aa 组成。

M 类基因的 M1、M2、M3 片段分别编码 μA、μB、μNS 蛋白。M1 基因由 2 283 nt 组成，编码的 μA蛋白由 732 aa 构成，相对分子质量约 82 ku［12］；M2基因由2 158 nt 组成，编码相对分子质量约73 ku的 μB 蛋白；M3 基因由 1 996 nt 组成，编码相对分子质量约71 ku 的μNS 蛋白。

S 类基因的 S1、S2、S3、S4 分别编码 p10、p17、σC、σA、σB、σNS 蛋白。S1 基因全长 1 643 nt，是独一无二的功能性三顺反子基因［13］。该基因含有3个相互重叠的ORF，可分别编码p10、p17、σC 3种蛋白［14］；S2 基因全长为 1 324 nt，其编码的 σA蛋白由 416 aa 组成，相对分子质量约 46 ku［15］；S3 基因全长1 202 nt，编码由367 aa 组成且相对分子质量约 41 ku 的 σB 蛋白；S4 基因全长 1 192 nt，编码的σNS 蛋白由367 aa 组成，相对分子量约66.2 ku。

2.1 结构蛋白 λA 蛋白是由ARVL1 基因编码的相对分子量约142 ku 的结构蛋白。该蛋白同ARV的其他衣壳蛋白一起将病毒的RNA 聚合酶和基因组片段包裹住，形成了ARV 的组装框架［16］。LIN等［17］发现，λA 蛋白的基因保守度非常高，在 μNS蛋白的介导作用下，能进到病毒加工厂内。

λB 蛋白是构成病毒衣壳的成分之一，能在融合感染细胞后形成合胞体，其是诱导宿主产生群特异性中和抗体的抗原［18］。

λC 蛋白是病毒封闭酶。λC 蛋白贯穿病毒的内外衣壳层，是病毒mRNA 的加帽酶。λC 蛋白在螺旋、延伸、转角以及无规则卷曲构象上与同源哺乳动物呼肠孤病毒（mammalian reovirus，MRV）的 λ2 蛋白基本相同，均可引起感染细胞发生融合并形成合胞体。

μA 蛋白是病毒内层衣壳的组成成分，可与λA 蛋白产生互作关系，且该蛋白为RNA 聚合酶（RdRp）的辅助因子。

μB 蛋白是由M2 基因编码的结构蛋白，是病毒外层衣壳的主要组成结构，参与病毒进入细胞的过程。

σA 蛋白是组成病毒内层核衣壳的结构蛋白。该蛋白能与双链DNA 进行非特异性结合，并可通过与dsRNA 序列相结合的方式抑制蛋白激酶的活化过程，从而抑制干扰素分泌［19］。HUANG 等［20］研究表明，σA 蛋白上有抗原表位结构存在，在临床上可被作为血清标记物，鉴别诊断ARV 感染。卢恒［21］采取酵母双杂交技术选出与ARVσA 蛋白相互作用的宿主蛋白，为进一步研究ARV 病毒分子的致病机理奠定了基础。

σB 蛋白是由ARV S3 基因编码，其开放阅读框为 1 104 bp，由 367 aa 构成［22］，相对分子质量约41 ku。该蛋白是病毒外衣壳的次要组分［23］，且携带有特异性抗原表位，能诱导机体产生针对病毒的群特异性中和抗体并引起宿主细胞融合，除此之外该蛋白还具有提高ARV 感染细胞的能力。

σC 蛋白是由S1 基因的ORF-3 编码的蛋白，是一种同源三聚体，可促进宿主细胞间的黏附并诱导中和抗体产生及分泌［24］。σC 蛋白在ARV 外层衣壳内含量较低，但仍是构成外层衣壳不可缺少的成分。在ARV 编码的蛋白中，σC 蛋白携带有特异性抗原表位，具有良好的免疫原性，在ARV 诱导免疫应答过程中发挥重要作用［25］。σC 蛋白是ARV 中唯一能够吸附易感细胞且能够促进细胞凋亡的病毒蛋白［26］。此外，PALOMINO 等［27］研究发现，σC蛋白不仅参与病毒附着，且可携带有特异性的中和反应表面抗原，因此易受中和抗体影响。σC 编码蛋白是所有ARV 的S 类基因中，核苷酸变异性最大的［28］，也是特异性中和抗体的唯一靶点［29］，因此σC 蛋白已成为开发抗ARV 亚单位疫苗的主要靶点。谭伟等［30］经过对调控 p10、p17 和 σC 3 种病毒蛋白表达的相关因子的研究，发现了抑制ARV 在细胞内复制的关键靶位，表明σC 蛋白可为疫苗研制的相关蛋白。

2.2 非结构蛋白 p10 是由ARV S1 基因编码的相对分子量约10.3 ku 的非结构蛋白，属于Ⅰ型跨膜蛋白，是ARV 必要的毒力因子。其可在细胞膜上穿孔，破坏宿主细胞细胞膜，促使细胞发生融合引起合胞体形成，进而有利于病毒扩散的作用。WU 等［31］证明，p10 蛋白是一种负责诱导细胞合胞体形成和凋亡的病毒素，能在宿主细胞中迅速降解，研究还发现，p10 的快速降解与泛素化有关。陈祥［32］通过免疫共沉淀和激光共聚焦显微镜检测技术进行的体外泛素化试验发现，ARV 感染宿主细胞后，ARV 的p10 蛋白与E3 泛素连接酶Siah-1 进行连接，起到桥梁的作用，使p10 蛋白降解，进而抑制病毒增殖。

p17 蛋白由ARV S1 基因的第2个开放阅读框ORF-2 编码，是一种核质穿梭蛋白［33］。CHIU 等［34］的研究表明，p17 蛋白通过转录依赖和染色体维持蛋白 1（chromosome maintenance protein 1，CRM1）的独立机制在细胞核和细胞质之间持续穿梭。李晨曦［35］的研究表明，p17 蛋白为一种多功能病毒蛋白，可通过激活10 号染色体上缺失的磷酸酶、张力蛋白和腺苷酸活化蛋白激酶，以及双链RNA 依赖的蛋白激酶所在自噬信号通路来触发自噬进而促进病毒复制［36］。该蛋白在调控细胞周期及蛋白翻译方向上有重要意义。

σNS 蛋白由ARV S4 基因编码，在病毒RNA 的包装和复制过程中发挥重要作用。其能结合单股RNA，并且与病毒mRNA 组的基因复制有一定联系。σNS 蛋白可在感染或转染的细胞浆内形成包涵体，在病毒早期形成过程中起关键作用［37］。

μNS 蛋白是由ARV 的M3 基因在感染细胞中表达的异构体，其相对分子量约71 ku。RODRIGUZE等［38］证明，μNS 蛋白是 ARV 感染过程中激活的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase3）-样蛋白酶催化加工而成的。

3 ARV 疫苗的研究现状

3.1 亚单位疫苗 在ARV 的蛋白中，σC 蛋白是ARV特异性抗体的唯一靶点，因此该蛋白也成为亚单位疫苗研制的主要蛋白。LU 等［39］以植物为研究对象免疫家禽抗ARV 感染的疫苗，将表达的σC 蛋白分别靶向于亚细胞结构细胞质或叶绿体。外壳蛋白σC 可作为研发抗呼肠孤病毒亚单位疫苗的主要候选基因之一。李天芝等［40］通过研究发现，将重组σC 蛋白纯化后，与ARV 的S1133 株分别对番鸭攻毒，结果显示，重组的σC 蛋白刺激机体产生保护性中和抗体，与商品化S1133 全病毒灭活苗的效果大致相当。表明重组σC 蛋白具有较好的免疫保护效果，为ARV 亚单位疫苗的成功研制奠定了基础。徐延伟［41］用法国佐剂乳化后的σC 蛋白肌肉注射21 日龄SPF 鸡，4 周后进行加强免疫，每周采血检测抗体滴度。结果表明，σC 蛋白可阻止ARV 在体内的复制，且能够对感染病毒进行清除。吴晓平等［42］对pET-30a-S3 ／ BL21 重组菌（σB 蛋白）与 pET-30a-S4 ORF2 ／ BL21 重组菌（σC 蛋白）进行了稳定性试验研究。将表达的重组蛋白经纯化和复性后，进行油乳剂制备。将50 只1 日龄雏鸭分为5 组，每组10 只：鸭呼肠孤病毒（duck reovirus，DRV）σB 蛋白免疫组、DRV σC 蛋白免疫组、DRV σB + σC 蛋白免疫组、PBS 对照组和攻毒对照组。将重组菌皮下注射（500 μg ／ 只）雏鸭，7 d 后进行 2 次免疫，14 d 后进行攻毒。ELISA 法和琼脂扩散试验检测抗体水平及保护指数，结果显示，2 免后 7 d 产生抗体，DRV σB +σC 和 DRV σC 蛋白免疫组雏鸭血清抗体 ELISA 效价均为 1 ∶200，高于 DRV σB 蛋白免疫组（1 ∶100）。攻毒试验结果显示，DRV σB + σC 蛋白联合免疫保护指数最高，为70，DRV σC 蛋白免疫组保护指数为60，DRV σB 蛋白免疫组保护指数最差，仅为 40。以上结果证明，DRV σB + σC 蛋白联合免疫组与DRV σC 蛋白免疫组均具有良好的免疫保护性，其中DRV的 σC 蛋白与 ARV 的 σC 蛋白相似，因此 ARV 的σC蛋白也具有免疫保护性。

亚单位疫苗能够引起机体的免疫反应，具有很强的交叉免疫保护作用，降低了免疫副作用。

3.2 核酸疫苗 蒋慷慨［43］成功构建了σC 蛋白的真核表达质粒 pCIS3、pCIS4ORF2 和 pCIS3 + pCIS4ORF2。将其肌肉注射 2 日龄番鸭（100 μg ／ 只），免疫7 d 后用相同药量和途径加强免疫，加强免疫1周后，用 10-7.1934TCID50／ 0.1 mL 病毒液进行攻毒，0.2 mL ／ 只。结果显示，pCIS3 组对番鸭的免疫保护作用可达80%，pCIS4ORF2 组可产生90%的免疫保护作用，pCIS3 + pCIS4ORF2 组对番鸭的免疫保护作用可达100%。表明构建的σC 蛋白真核表达质粒对番鸭有较好的免疫保护效果。

3.3 活载体疫苗 活载体疫苗是最具发展空间的疫苗之一。该疫苗作用效果好、较稳定且免疫方法简单。万俊杰［44］构建了能表达σC 蛋白基因的重组减毒沙门菌 SL7207（pVAX-σC）、SL7207（pVAXAB-σB-σC），以 1.0 × 109CFU 剂量免疫雏鸡，结果显示，经过免疫后能诱导机体产生较高的ARV σC 蛋白的特异血清抗体，且 SL7207（pVAX-σC）比 SL7207（pVAXAB-σB-σC）能更好地诱导机体产生特异性中和抗体。王存伟［45］构建了ARVσC 基因重组减毒沙门菌，应用雏鸡对其进行检测，证明疫苗安全、稳定。以上试验表明，σC 蛋白具有与ARV 相同的免疫活性，以该蛋白为核心研制的活载体疫苗在临床上有良好的免疫效果。

4 展 望

研制疫苗防控禽呼肠孤病毒病是既经济又有效的手段，但传统疫苗在安全性、有效性等方面存在些许缺陷。近年来，ARV 基因工程疫苗的研制取得了较大进步，目前已有多种疫苗应用于临床试验中。在ARV 疫苗研制中，σC 蛋白起到重要作用，成为疫苗研制的候选基因。对ARV 结构蛋白的免疫保护性进行不断的研究和探索，将会为其基因工程疫苗的成功研制奠定一定的理论基础，从而全面、有效地防控禽呼肠孤病毒病。