个体化细胞及核酸治疗性肿瘤疫苗临床药效学研究概况

贺庆，张横 综述，王军志 审校

中国食品药品检定研究院创新疫苗及生物技术产品评价与标准化国家重点实验室，北京 102629

肿瘤是一种多基因参与、多步骤发展的全身性、系统性疾病，基因组稳定性丧失是肿瘤细胞基本特征之一，其异常生物学行为主要表现为无限复制、血管生成、侵袭与转移、免疫逃逸等。目前，肿瘤所致人口死亡数约占我国人口死亡总数的23%，且发病率不断上升，已成为威胁人类生命健康的首要疾病［1-2］。随着对肿瘤发生发展机制认识的不断深入及肿瘤放化疗显现出的诸多缺陷，目前免疫治疗（包括免疫检查点抑制剂、过继细胞治疗、细胞因子和肿瘤疫苗）已成为治疗肿瘤的趋势和主流［3-4］，特别是肿瘤疫苗对防治肿瘤复发和转移具有较强优势，已逐渐引起人们的关注。患者肿瘤异质性和人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）异质性是影响肿瘤疫苗药效作用的关键因素［5-6］。细胞疫苗含有肿瘤细胞的所有抗原，设计和生产疫苗前无需对这些抗原进行系统而繁琐的鉴定，制备时间较短；核酸疫苗设计灵活，可同时编码肿瘤抗原和免疫调节分子，易于量产。针对这两类疫苗的特点，开发个体化治疗性肿瘤疫苗已成为该领域的研究热点和未来方向［7-9］，对相关产品的科学监管也应引起重视。本文对2002 — 2020年期间个体化细胞与核酸治疗性肿瘤疫苗的Ⅰ～Ⅲ期临床药效学研究概况作一综述，以期为该类疫苗的相关研发和评价监管提供参考。

1个体化细胞治疗性肿瘤疫苗的临床药效学研究

目前，处于临床研究阶段的个体化细胞治疗性肿瘤疫苗主要包括个体化树突状细胞（dendritic cell，DC）治疗性肿瘤疫苗和个体化肿瘤细胞治疗性肿瘤疫苗，大多数处于Ⅰ期 ／ 初期（14 项，治疗包括胶质母细胞瘤、黑色素瘤、肾细胞癌、B 细胞淋巴瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞白血病和胰腺癌）和Ⅱ期（4 项，治疗包括黑色素瘤、卵巢癌和胶质母细胞瘤）临床研究阶段，少数处于Ⅲ期（1 项，治疗包括胶质母细胞瘤）临床研究阶段。

个体化DC 治疗性肿瘤疫苗发展初期的设计思路一般是利用患者自体肿瘤制备肿瘤裂解物（autologous tumor lysate，ATL）融合性 DC，随着基因深度测序、蛋白质组学和生物信息学技术发展，可利用上述技术分析患者自体肿瘤的新抗原，制备肿瘤新抗原肽融合性DC；个体化肿瘤细胞治疗性肿瘤疫苗的整体设计思路一般是利用患者ATL 作为免疫原。上述疫苗联合佐剂可经皮下或淋巴结内注射免疫患者，其临床药效学研究一般侧重评价疫苗的特异性细胞免疫原性。

1.1个体化DC 治疗性肿瘤疫苗的临床药效学研究

1.1.1 ATL 融合性DC 与钥孔戚血蓝素（keyhole limpethemocyanin，KLH）融合性 DC 的混合疫苗 2002年，CHANG 等［10］对该混合疫苗治疗晚期癌症（14 例）进行了一项Ⅰ期研究。疫苗经皮内注射免疫晚期癌症患者，免疫前后患者的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）与 ATL 或 KLH 共同孵育，ELISPOT-IFNγ 法、流式细胞术-MHC ／ 肽四聚物+T 细胞法检测抗原特异性T 细胞，评价疫苗的细胞免疫原性；将ATL 或KLH 刺激后的PBMCs 与氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine）共同孵育，对［3H］标记的细胞进行计数，评价T 细胞增殖情况；免疫前后经患者皮内注射ATL 抗原或KLH，检测皮肤硬化情况，评价延迟型超敏反应（delayed-type hypersensitivity，DTH）；光镜和免疫组化法分析疫苗接种部位血管周围浅表淋巴细胞浸润情况。结果显示，该疫苗不会引起患者产生Ⅲ或Ⅳ级毒副反应及自身免疫疾病；疫苗接种部位出现CD4+和CD8+T 细胞的局部积累；可诱导患者PBMCs 产生针对KLH 的增殖反应；可诱导患者产生针对自体肿瘤（3 ／ 7）和 KLH（5 ／ 6）的细胞免疫反应及针对自体肿瘤（4 ／10）和KLH（8 ／9）的DTH；2 例黑色素瘤患者分别出现了部分和轻微的临床反应。

1.1.2 自体肿瘤肽融合性DC 疫苗 2005年，LIAU等［11］对一种自体肿瘤肽融合性DC 疫苗治疗胶质母细胞瘤（12 例）进行了一项Ⅰ期研究。疫苗经皮内注射免疫胶质母细胞瘤患者，将免疫前后患者的外周血T 细胞与自体肿瘤细胞共同孵育，采用Alamar蓝细胞毒 T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）试验评价T 细胞对靶细胞的杀伤作用。结果显示，该疫苗未引起患者产生毒性或严重不良反应；1 例患者产生客观临床反应，6 例患者检测到抗肿瘤CTL 反应；免疫后再次手术的8 例患者中，4 例产生肿瘤内浸润性CTL 增加，T 细胞浸润大小与肿瘤内TGF-h2 的表达呈负相关，与临床生存期呈正相关；受试患者的肿瘤进展时间（time to tumor progression，TTP）和总生存期（overall survival，OS）显著长于对照组。

1.1.3 ATL 融合性 DC 疫苗

1.1.3.1 单独使用ATL 融合性DC 疫苗 2011年，FADUL 等［12］对 ATL 融合性 DC 疫苗治疗多形性胶质母细胞瘤（10 例）进行了一项Ⅰ期临床研究。ATL经皮内注射免疫患者，测量注射部位皮肤红斑和硬结大小，评价患者DTH。疫苗经颈淋巴结内注射免疫患者，将免疫前后患者的淋巴细胞与疫苗共同孵育，ELISPOT-IFNγ 法评价疫苗的细胞免疫原性；染料稀释增殖试验（dye dilution proliferation assay，DDPA）评价T 细胞增殖和免疫反应；流式细胞术分析疫苗和外周血T 细胞表型特征；Kaplan-Meier 曲线分析患者无进展生存期（progression-free survival，PFS）和 OS。结果显示，疫苗不会引起患者产生严重不良反应；可显著增加患者肿瘤特异性CD4+T 细胞；患者6个月PFS 为 90%，中位 PFS 为 9.5 月，OS 为 28 月；患者肿瘤特异性免疫反应的产生与生存期的延长具有相关性。

1.1.3.2 ATL 融合性DC 疫苗联合 IL-2 2006年，WEI 等［13］对 ATL 融合性 DC 疫苗 Dendritomas 联合低剂量IL-2 治疗转移性黑色素瘤（10 例）进行了一项Ⅰ期临床研究。Dendritomas 联合低剂量IL-2 经皮下注射免疫转移性黑色瘤患者，将免疫前后患者的血液与 ATL 共同孵育，流式细胞术-IFNγ+、CD4+／ CD8+、CD69+T 细胞法检测抗原肽的细胞免疫原性。结果显示，患者（8 ／9）可对疫苗产生T 细胞反应；1 例患者产生完全反应，2 例患者病情稳定（分别为9 和4个月）；疫苗产生的不良反应小于Ⅱ级，具有较好耐受性。

2007年，WEI 等［14］对 Dendritomas 联合低剂量IL-2 治疗Ⅳ期肾细胞癌（10 例）进行了一项初步临床研究。Dendritomas 联合低剂量IL-2 经皮下注射免疫Ⅳ期肾细胞癌患者，将患者血液或PBMCs 与ATL共同孵育，流式细胞术-IFNγ+、CD4+／ CD8+、CD69+T细胞法或ELISA-IFNγ 法检测抗原肽的细胞免疫原性。结果显示，免疫后患者的CD4+T 细胞反应率为100%（9 ／ 9），CD8+T 细胞反应率为 62.5%（5 ／ 8）；患者的临床反应率为40%；疫苗具有较好耐受性。

2016年，GREENE 等［15］对 Dendritoma 联合低剂量IL-2 治疗黑色素瘤（25 例）进行了一项Ⅰ ／ Ⅱa期研究。Dendritomas 联合低剂量IL-2 经皮下注射免疫黑色素瘤患者，结果显示，所有受试患者的中位OS 为16.1 月，预计5年生存率为29%；疫苗接种次数 ≥ 3 次的受试患者中位OS（21.5 月）显著长于接种次数＜3 次的受试患者（8.3 月），且差异有统计学意义（P = 0.02）；参与Ⅰ期（10 例）与Ⅱa 期（15 例）研究的受试患者无临床病理差异，Ⅱa 期受试患者疫苗接种次数多于Ⅰ期受试患者，Ⅱa 期受试患者的中位 OS（23.8 月）显著长于Ⅰ期受试患者（8.7 月），且差异有统计学意义（P = 0.004）；疫苗联合IL-2 疗法的毒性小于Ⅲ级。

1.1.3.3 ATL 融合性 DC 疫苗（DCVax-L）联合其他疗法 2013年，KANDALFT 等［16］对 DCVax-L 联合抗血管生成疗法或再过继移植体外活化的T 细胞治疗复发性卵巢癌（6 例）进行了一项Ⅰ期临床研究。疫苗经皮内注射免疫复发性卵巢癌患者，将免疫前后患者的PBMCs 与疫苗共同孵育，或将扩增并经预刺激的CD8+T 细胞分别与转染HLA-A2 的SKOV3 细胞、HER2 ／neu 369 或 689 肽融合性 T2 细胞、SKOV3细胞裂解物融合自体DCs 共同孵育，ELISPOT-IFNγ法评价疫苗的细胞免疫原性；免疫组化法分析肿瘤内浸润性CD3+T 细胞和MHCⅠ表达水平；流式细胞术分析患者外周CD4+CD25+FOXP3+调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）水平；蛋白芯片法检测患者血清IgG 和IgM 含量。结果显示，疫苗免疫组（6 例）具有较好耐受性，不会产生大于Ⅱ级的毒副反应；疫苗联合抗血管生成疗法可引起4 名患者（6 例）产生抗肿瘤免疫反应和临床效益；过继移植体外活化的T 细胞可降低2 名患者（3 例）外周Tregs 细胞水平；疫苗可引起患者（2 例）血清IgG 和IgM 阳转率升高。

2018年，LIAU 等［17］对 DCVax-L 治疗胶质母细胞瘤（331 例）进行了一项Ⅲ期研究。疫苗经皮内注射免疫胶质母细胞瘤患者，结果显示，受试患者（331例）的术后中位OS 为23.1 月，3年生存率为25.4%；甲基化O6 甲基鸟嘌呤DNA 甲基转移酶型（O6-methylguanine-DNAmethyltransferase，MGMT）受试患者（131 例）的术后中位 OS 为 34.7 月，3年生存率为46.4%；仅2.1%受试患者（7 例）出现Ⅲ或Ⅳ级不良反应，其总体不良反应与单独标准疗法相当，疫苗具有较好耐受性；该疫苗联合标准疗法治疗胶质母细胞瘤是可行和安全的，并可延长生存期。

1.1.3.4 ATL 融合性DC 疫苗与胶质瘤相关抗原（glioma-associated antigen，GAA）融合性 DC 疫苗的比较 2013年，PRINS 等［18］对 ATL 融合性 DC 疫苗（28 例）和胶质瘤相关抗原（glioma-associated antigen，GAA）融合性DC 疫苗（6 例）治疗恶性胶质瘤各进行了一项Ⅰ期研究。疫苗经皮内注射免疫恶性胶质瘤患者，流式细胞术检测患者外周血中免疫细胞（如CD3+CD4+辅助性 T 细胞、CD3+CD8+CTL、CD3-CD16+NK、CD3+CD16+自然杀伤 T 细胞、CD3-CD19+B 细胞、CD3+CD4+CD25+CD127lowTreg 增殖情况。结果显示，ATL 融合性DC 疫苗引发的抗肿瘤免疫反应具有更好的特异性和多样性；两种疫苗接种后／ 接种前Treg比率的降低与患者生存时间的延长具有显著相关性；两种疫苗的不良反应率和严重程度相似，主要为Ⅰ～Ⅱ级不良反应。

1.1.4 自体肿瘤融合性 DC 疫苗 2009年，DI NICOLA 等［19］对自体肿瘤融合性 DC 疫苗治疗 B 细胞淋巴瘤患者（18 例）进行了一项初步临床研究。疫苗经皮下注射免疫B 细胞淋巴瘤患者，将免疫前后患者的外周血来源淋巴细胞与抗原肽共同孵育，或将淋巴结来源T 细胞与自体B 肿瘤细胞共同孵育，ELISPOT-IFNγ ／ IL-4 法评价疫苗的细胞免疫原性；流式细胞术检测患者外周血和淋巴结中CD4+CD25+FOXP3+T 细胞（Tregs）、外周血 CD56dimCD16+CD3-细胞［自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）］和肿瘤部位CCR7+CD45RA+CD3+CD8+细胞（成熟T 细胞）的增殖情况，评价疫苗的反应效应。HLA 稳定试验分析肽段与HLA-A2 的结合情况。结果显示，该疫苗可同时诱导受试患者产生T 细胞和B 细胞应答；18 例受试患者中6 例产生客观临床反应（3 例产生持续完全反应，3 例产生部分反应），中位随访时间为50.5 月；8 例患者病情稳定，4 例病情有进展。

1.1.5个体化全肿瘤细胞裂解物融合性DC 疫苗2012年，CHO 等［20］对一种个体化全肿瘤细胞裂解物融合性DC 疫苗治疗多形性胶质母细胞瘤（34 例）进行了一项Ⅱ期研究。疫苗经皮下注射免疫多形性胶质母细胞瘤患者，以OS、存活率、PFS、生活质量和不良反应为评价指标。结果显示，疫苗组（18 例）的1、2 和3年存活率分别为88.9%、44.4%和16.7%，对照组（16 例）分别为75.0%、18.8%和0%（P 分别为 0.299 0、0.003 5、0.001 4）；疫苗组和对照组的中位 OS 分别为 31.9 和 15.0 月（P ＜ 0.002），中位 PFS分别为 8.5 和 8.0 月（P = 0.075）；Kaplan-Meier 分析显示，疫苗组的存活率显著高于对照组。

1.1.6 次氯酸氧化型ATL 融合性DC（HOCl-oxidized autologous whole tumorlysate-pulsed DCs，OCDC）疫苗2013年，CHIANG 等［21］对一种 OCDC 的个体化疫苗治疗卵巢癌（5 例）进行了一项Ⅰ期临床研究。疫苗经淋巴结内注射免疫卵巢癌患者，将免疫前后患者的PBMCs 与疫苗共同孵育，ELISPOT-IFNγ 法、流式细胞术-HER-2／neu 四聚物+CD8+T 细胞法检测培养液中Th1（IFNγ）、Th2 细胞因子（IL-10、IL4、IL-5）和 IL-17的浓度，评价疫苗的细胞免疫原性；同时检测免疫前后患者 PBMCs 中 IFNγ+CD3+／ Treg 细胞比率和血清IL-10 浓度，评价患者的免疫状态。结果显示，疫苗具有较好耐受性；可有效诱导患者产生T 细胞反应，并引起患者外周Treg 细胞和血清IL-10 降低；2 例患者接种疫苗后产生＞24 月的PFS。

1.1.7个体化肽融合性DC 疫苗 2017年，SHEN等［22］根据肝癌的肿瘤突变和表达范围建立候选抗原肽文库，参考免疫前患者针对这些候选肽的细胞免疫原性选择相应的候选抗原肽作为免疫原，将这些个体化肽融合DC 制备成疫苗。疫苗经皮下注射免疫患者，并将该疫苗体外活化的CTL 过继输入患者体内，对该个体化疫苗（PPV-DC-CTL）联合放射疗法治疗晚期肝癌（9 例）进行了一项Ⅰ期研究，结果显示，该疗法不会引起患者产生严重不良反应，具有较好耐受性，且可较好控制患者疾病（反应率为33%，疾病控制率为 66%，9 例）。

1.1.8 肿瘤新抗原肽融合性DC 疫苗 2018年，TANYI 等［23］采用全外显子测序和HLAⅠ-肽预测性结合算法（如NetMHC-3.4）分析肿瘤的突变肽（肿瘤新抗原肽），对一种OCDC 制备的个体化疫苗治疗卵巢瘤（25 例）进行了一项Ⅰ期研究。该疫苗经淋巴结注射卵巢癌患者，以免疫前和免疫中患者PBMCs来源的CD4 和CD8 T 细胞作为效应细胞，OCDC 及自体肿瘤细胞作为抗原提呈细胞，ELISPOT-IFNγ 法，流式细胞术-IL-2±、TNF-α±、IFNγ±、突变肽-MHC 多聚物±、CD4±／ CD8±T 细胞法评价自体肿瘤细胞和突变肽的细胞免疫原性，51Cr 释放试验评价治疗中效应细胞（CD3 ／ CD28-扩增型 PBMCs）对靶细胞（自体肿瘤细胞）的杀伤效果，NSG 小鼠建立患者自体肿瘤移植瘤模型评价治疗中效应细胞（CD3 ／ CD28-扩增型PBMCs）对肿瘤生长的抑制作用。结果显示，该疫苗可诱导患者产生针对自体肿瘤抗原的T 细胞反应，该反应与显著延长患者的生存期具有相关性；疫苗也可增强患者产生针对肿瘤非同义体细胞突变肽的T细胞反应（包括免疫后新诱导产生的新表位特异性T细胞反应，以及免疫前预先存在的新表位T 细胞产生针对新表位具有更高亲合力的T 细胞克隆）；疫苗共免疫392 剂均未发生严重不良反应；疫苗治疗中产生的T 细胞对NSG 小鼠体内移植瘤的抑制作用显著强于治疗前的T 细胞。

2019年，SARIVALASIS 等［24］采用测序、质谱和HLA-肽预测性结合算法分析肿瘤的突变肽（肿瘤新抗原肽），对 ATL 融合性 DC 疫苗（OCDC）及 OCDC联合肿瘤新抗原肽融合性DC 疫苗（PEP-DC）治疗晚期高度浆液性卵巢癌（16 例）进行了一项Ⅰ ／ Ⅱ期研究。疫苗经淋巴结内注射免疫卵巢癌患者，用免疫前后患者PBMCs 和肿瘤浸润性淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocytes，TILs）制备的 CD4±和 CD8±T 细胞作为效应细胞，ELISPOT-IFNγ 法评价抗原肽的细胞免疫原性。结果显示，依次采用OCDC、PEP-DC治疗患者的方法可产生较好的效果，能促进患者产生多种抗原特异性的免疫反应，扩增已存在的新抗原特异性T 细胞克隆。

2019年，BASSANI-STERNBERG 等［25］采用外显子组测序、质谱、HLA-Ⅰ和Ⅱ-肽预测性结合算法（如MixMHCpred.v2.0.2、MixMHC2pred.v1）分析肿瘤的HLA-Ⅰ和Ⅱ-结合肽，对PEP-DC 联合药物（吉西他滨 ／ 卡培他滨、阿司匹林、纳武单抗）治疗切除型胰腺癌患者（3 例）进行了一项Ⅰb 期研究。疫苗经皮下注射免疫切除型胰腺癌患者，将免疫前后患者的PBMCs 与抗原肽共同孵育，流式细胞术-ICS（CD3、CD8、CD4、IL-2、TNF-α 和 IFNγ）法检测抗原肽的细胞免疫原性。结果显示，患者中抗原特异性CD4+T 细胞产生率为 100%（3 ／ 3）。

1.1.9 ATL 颗粒负荷性DC 疫苗（autologous tumor lysate，particle-loaded，dendritic cell，TLPLDC） 2018年，HERBERT 等［26］对 TLPLDC 治疗实体瘤（44 例）进行了一项Ⅰ ／ Ⅱa 期临床研究。结果显示，TLPLDC具有较好安全性，主要表现为Ⅱ级以下毒性反应，最常见为流感样症状；39%（12 ／ 31）患者可产生临床获益（2 例完全反应、4 例部分反应和6 例疾病稳定）。

1.1.10 肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA）mRNA 转染性 DC 疫苗 2020年，WANG 等［27］对一种转染TAA mRNA 的个体化DC 疫苗联合低剂量环磷酰胺、poly I：C、咪喹莫特和anti-PD-1 抗体治疗实体瘤（多形性胶质母细胞瘤和脑转移型非小细胞肺癌，各5 例）进行了一项Ⅰ期研究。疫苗同时经皮下和静脉注射免疫实体瘤患者，用免疫前后患者PBMCs及其制备的非黏附型T 细胞作为效应细胞，自体TAA融合性成熟DC 作为抗原提呈细胞，流式细胞术-CD3+、CD4+／ CD8+、IFNγ+、TNF-α+细胞法检测 TAA 特异性T 细胞（细胞免疫原性）。结果显示，在接受细胞免疫原性反应测试的7 名患者中，大多数TAA 可诱导产生特异性CD4+和CD8+T 细胞反应，其与TAA 在肿瘤组织中的表达水平无关，这些患者均未发生明显自身免疫性不良反应，T 细胞反应与患者产生较好的总体生存率相关。

1.2个体化肿瘤细胞治疗性肿瘤疫苗的临床药效学研究

1.2.1 自体慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）肿瘤细胞疫苗（CLL ／GM-K562） 2013年，BURKHARDT 等［28］对 CLL ／ GM-K562 治疗同种异体造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）后早期的 CLL 患者（18 例）进行了一项Ⅰ期临床研究。疫苗经皮下和皮内注射免疫CLL 患者，将免疫前后患者PBMCs 与自体肿瘤细胞共同孵育，ELISPOT-IFNγ 法检测CLL 特异性CD8+T 细胞反应，Luminex 法检测培养液中GM-CSF、TNF-α、IL-2 和 IL-10，评价 CD8+T 细胞功能。结果显示，接种疫苗患者的2年PFS 和OS 分别为82%和88%；免疫后患者的17%CD8+T 细胞克隆可对CLL 相关抗原产生反应。

1.2.2 自体肿瘤细胞疫苗（Gliovac） 2015年，SCHIJNS等［29］对联合同种异体和自体神经胶质瘤细胞裂解物的肿瘤细胞疫苗（Gliovac）治疗多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）（9 例）进行了一项Ⅰ期研究。疫苗经皮内注射免疫GBM 患者，结果显示，9 例患者的26 周生存率为 100%（对照组为33%），40 周存活率为77%；该疫苗具有较低的毒性和较好的疗效。

2个体化核酸治疗性肿瘤疫苗的临床药效学研究

个体化核酸治疗性肿瘤疫苗的整体设计思路一般为分析并采用编码患者自体肿瘤突变肽／ 新抗原的核酸作为免疫原，将其联合佐剂免疫患者。目前，仅有少量核酸疫苗处于Ⅰ或Ⅰ ／ Ⅱ期（2 项，治疗包括黑色素瘤和胃肠癌）临床研究阶段，且为RNA 或mRNA 疫苗，其临床药效学研究也侧重评价疫苗的特异性细胞免疫原性。

2.1个体化突变肽 RNA 疫苗 2017年，SAHIN 等［30］对一种编码肿瘤患者个体化突变肽的RNA 疫苗治疗黑色素瘤（13 例）进行了一项Ⅰ期研究。疫苗经腹股沟淋巴结注射免疫黑色素瘤患者，以免疫前后患者血液中CD4+和CD8+T 细胞作为效应细胞，转染编码突变肽RNA 的辐照灭活性自体CD4-或CD8-PBMCs 作为抗原提呈细胞，ELISPOT-IFNγ 法评价突变肽的细胞免疫原性。T 细胞作为效应细胞，负荷新表位RNA 的自体DCs 作为抗原提呈细胞，流式细胞术分选单个IFNγ+CD8+T 细胞，鉴定其T细胞受体（T cell receptors，TCR）克隆。同时，将转染抗原特异性 TCR-α ／ β 链的健康人 CD8+T 细胞作为效应细胞，表达患者相应HLA 等位基因和抗原表位肽的K562 细胞系作为抗原提呈细胞或靶细胞，ELISPOT-IFNγ 法验证 CD8±抗原-HLA 间作用的特异性，采用caspase 3 ／ 7 或荧光素酶反映靶细胞凋亡情况或毒性。结果显示，该个体化突变肽RNA 疫苗可有效诱导患者产生抗原特异性多克隆抗肿瘤T 细胞免疫反应；13 例黑色素瘤患者的125个新表位中，60%具有免疫原性，每个患者可至少针对3个突变新表位产生T 细胞免疫反应；75个具有免疫原性的新表位中，32%在患者体内预先存在免疫原性，68%在患者体内无预先存在免疫原性；72个具有免疫原性的新表位中，57%仅产生CD4+T 细胞反应，17%仅产生CD8+T 细胞反应，26%可同时产生CD4+和CD8+T 细胞反应。接种疫苗后，患者的肿瘤转移显著降低，约75%患者的PFS 为27 月。

2.2 肿瘤新抗原mRNA疫苗（mRNA-4650） 2020年，CAFRI 等［31］采用全外显子测序（whole-exome sequencing，WES）、转录组测序（RNA-Seq）和 HLA-Ⅰ ／ Ⅱ-肽预测性结合算法（如netMHCpan-3.0、netMHCpanⅡ-3.1）分析患者的肿瘤新抗原，对一种编码新抗原的mRNA 疫苗（mRNA-4650）治疗转移性胃肠癌（4例）进行了一项Ⅰ／ Ⅱ期临床研究。疫苗经肌肉注射免疫转移性胃肠癌患者，以免疫前后患者PBMCs 分离的T 细胞作为效应细胞，将其与转染串联微基因（tandem minigene，TMG）或负荷抗原肽的 DC 共同孵育，再用负荷单个抗原肽的DCs 对其进行刺激，流式细胞术-4-1BB+法检测细胞对抗原的识别或ELISPOT-IFNγ 法检测抗原肽的细胞免疫原性。分选4-1BB 上调且经再刺激的COL6A3 反应阳性细胞，对其进行单细胞TCR 测序，将转染TCR 的外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocytes，PBLs）与 COL6A3-变异或野生肽融合性DCs 共同孵育；转染患者相应HLAsⅠ型分子且负荷相应抗原肽的COS-7 细胞作为抗原提呈细胞，将其与COL6A3 和OR10H1 特异性T 细胞共同孵育；流式细胞术-4-1BB+法检测细胞对抗原的识别。结果显示，该疫苗具有较好安全性；疫苗抗原中15.7%具有免疫原性，78.8%不具有免疫原性，5.5%预存在免疫原性；所有患者产生的新抗原特异性T 细胞反应中41%为CD8+T 细胞反应，59%为CD4+T 细胞反应；分离并验证得到可靶向KRASG120变异体的TCR；4 例受试患者未产生客观临床反应。

3 小 结

综上所述，患者对个体化DCs 治疗性肿瘤疫苗产生细胞免疫反应率约为70%；个体化RNA 治疗性肿瘤疫苗中约40%的新抗原具有免疫原性，其诱导的T 细胞反应中约60%为CD4+T 细胞反应；疫苗整体不会引起患者产生严重不良反应（一般为Ⅰ～Ⅱ级），耐受性较好。个体化DCs 治疗性肿瘤疫苗（DCVax-L）已开展1 项Ⅲ期临床研究，其联合标准疗法治疗胶质母细胞瘤是可行和安全的，并可延长患者生存期；个体化核酸治疗性肿瘤疫苗的临床研究正处于起步阶段。

研发治疗性肿瘤疫苗的关键是选定患者肿瘤特异性抗原，针对该个性化因素，精准筛选患者肿瘤特异性抗原正日益受到重视，也是治疗性肿瘤疫苗发展的未来趋势［32-34］。另外，影响肿瘤疫苗药效作用的共性因素（包括免疫佐剂、制剂类型和给药方式等）也应得到关注，个体化细胞治疗性肿瘤疫苗一般要求患者处于相对正常的免疫状态，需要患者提供数量较多的DCs 和肿瘤细胞［35-37］；个体化核酸治疗性肿瘤疫苗应重点关注提高免疫细胞摄取核酸的效率及核酸的稳定性［35，38-40］；只有综合考虑这些因素的影响，才能进一步提高治疗性肿瘤疫苗的药效。