基于现代生物学探讨中药对肾虚证动物模型生殖功能的影响*

赵均，宋春英，薛美昭，郭兴萍

1.山西白求恩医院(山西医学科学院)，山西省生殖科学研究所，山西 太原 030032；2.山西中医药大学，山西 晋中 030619

近年来，男性不育症的发病率逐年升高，其中以少弱精子症居多。中医药在防治男性不育症方面经验丰富，并取得了一定的进展[1]。中医学认为，肾藏精，主生殖，为先天之本，是生殖之源。肾足，机体发育就会健壮，生殖功能及其他生命活动就会正常；反之，肾虚，男性的性功能就会降低，精子在发生发育过程就会受到影响，甚至可能导致男性不育。因此，肾虚是男性少弱精子症的根本病机。少弱精子症的病位在肾、脾、肝，肾虚为本，与湿热、血瘀、肝郁密切关联，涉及脏腑、气血、外邪，虚实夹杂[2]。因此，不育症的病因病机是复杂的。但肾虚仍然是男性不育症常见的证型[3]。研究肾虚证型的致病机理是解决少弱精症患者不育的重要方法之一。临床以肾阳亏虚、肾阴亏虚和肾精不足最为常见[3]，主要治法为固肾涩精法、滋阴降火法、补肾益气法、补肾填精法、补肾滋阴法、补肾壮阳法等[4]。

随着对中医药研究的深入，模拟中医相关证候的动物模型已成为研究中医药治疗不育症作用机制的重要方法。由于肾虚证相关的疾病种类较多，肾虚证模型是研究较早且应用较多的一类动物模型，运用肾虚证动物模型研究其致病机理和相应的治疗方法也取得了一定的进展[5]。应用现代生物学技术揭示机体的生命规律已成为当前研究生命科学的重要途径之一。本文主要通过检索2005—2020年运用现代生物学的方法分析中药对3类常见肾虚证动物模型生殖功能的研究进展。

1 肾阳亏虚型

肾阳亏虚型动物模型常表现为：皮毛色泽暗淡，弓背，眯眼，怕冷蜷缩，阴囊皱缩，倦怠乏力，精神萎靡，行动缓慢，进食量和饮水量减少，体质量下降，小便频数，大便稀溏等。常用的造模方法包括腺嘌呤法、氢化可的松法、去势法、甲巯咪唑法、去甲状腺法、去肾上腺法、房劳过度法、惊恐伤肾法[6]。其中，腺嘌呤、氢化可的松和房劳过度法为常见的造模方法。

1.1 腺嘌呤法复制模型研究发现，腺嘌呤具有促进生精细胞凋亡和抑制生精的作用，被广泛用于建立肾阳虚型不育模型[7]。芳香化酶编码基因(cytochrome P19，CYP19)通过调节雌激素的合成调控精子生成，睾丸中的转化生成因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)既可以直接调节精子的形成过程，也通过抑制CYP19的表达影响精子生成[8]。对大鼠进行灌胃腺嘌呤建立肾阳虚不育模型发现，与正常对照组比较，模型组大鼠睾丸参与生精过程的CYP19mRNA和芳香化酶P450水平均显著下降[8]。研究发现，金匮肾气丸能显著提高肾阳虚不育症模型大鼠精子密度与存活率，增加血清性激素水平，升高大鼠睾丸组织中CYP19mRNA水平，降低TGF-β1mRNA水平，促进精子的生成[9-10]。Smads蛋白是TGF-β家族成员细胞内信号转导过程中的重要转录因子，可直接或间接影响TGF-β蛋白(如骨形态发生蛋白)的信号转导，参与调控精子的生成、发育及成熟等过程。腺嘌呤诱导的肾阳虚不育模型大鼠睾丸中参与调控精子发生、发育和成熟过程中的信号转导分子Smad1表达降低且Smad5不表达，当给予温阳生精汤后，Smad1蛋白表达水平显著升高，提示温阳生精汤可通过调节睾丸Smads表达，促进精子形成，治疗雄性不育[11-12]。补肾生精方能够增加模型大鼠的精液密度，提高精子的存活率及存活力，促进下丘脑-垂体分泌促卵泡生成素(follicle stimulating hormone，FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormones，LH)和睾酮(testosterone，T)，改善性腺轴的功能紊乱状态，并通过调节细胞信号转导分子Smads表达，促进精子的生成[13]。

腺嘌呤能够使B淋巴细胞瘤-2(b-cell lymphoma 2，Bcl-2)和Bax基因异常表达，引发生精障碍，形成弱精症或无精症，导致男性不育症。益精方可升高不育症大鼠睾丸中凋亡相关Bcl-2蛋白表达，降低Bax蛋白表达，抑制生精细胞凋亡[14]。

腺嘌呤还能诱发氧化应激，影响睾丸的内分泌功能而造成生殖系统损伤。益肾通络方可以修复腺嘌呤引发的模型大鼠的氧化应激损伤，升高体内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)活性，调节血清FSH、T和LH水平，保护大鼠生殖系统[15]。

血睾屏障能够为精子的发生提供稳定的微环境和免疫屏障，确保精子的顺利生成。睾丸支持细胞间的连接蛋白在调解血睾屏障中发挥了重要作用。益精方能有效提高腺嘌呤诱导的肾阳虚模型大鼠睾丸中蛋白激酶A以及抑制素B(inhibin B，INHB)的表达，调控睾丸支持细胞间连接黏附分子及闭合小环蛋白的表达，修复睾丸支持细胞紧密连接蛋白的损伤，恢复大鼠的生殖能力[16-17]。

1.2 氢化可的松法复制模型氢化可的松为人工合成的糖皮质激素，对下丘脑-垂体-性腺(睾丸)轴具有重要的影响，常用于构建肾阳虚型不育症模型[7]。氢化可的松注射液通过肌肉注射复制小鼠肾阳虚模型发现，模型组小鼠精子质量下降，附睾功能性指标精子膜甘油-3-磷酸胆碱含量升高，导致不育[18]。菟丝子总黄酮能明显改善肾阳虚模型小鼠的精子质量，促进血清T分泌，提高睾丸内乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)、酸性磷酸酯酶(acid phosphatase，ACP)、SOD和谷胱甘肽水平，降低MDA活性，下调凋亡相关基因Fas和Fasl水平[19]，提示菟丝子总黄酮治疗肾阳虚小鼠的作用与抗氧化应激和抗凋亡有关。

1.3 房劳过度法复制模型通过“劳倦过度、房事不节”的方法成功构建肾阳虚小鼠模型发现，该模型小鼠的生精功能发生障碍，各级生精细胞均有不同程度的损伤，抗凋亡基因Bcl-2水平下降，用金匮肾气丸进行治疗后可改善模型小鼠的免疫和生精功能[20]。肾气丸可显著恢复肾阳虚小鼠异常的性腺轴激素水平，提高睾丸中SOD和LDH活性，降低MDA、一氧化氮(nitric oxide，NO)含量以及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性[21]。

2 肾阴亏虚型

肾阳亏虚型动物模型常表现为：毛无光泽，眼窝下限，体温升高，心率加快，多动易惊，烦躁不安，饮水增多，进食量减少，体质量增长缓慢，形体消瘦，大便干结等。常用的造模方法有甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能亢进(氢化可的松、醋酸可的松、地塞米松、醋酸泼尼松)、高血压肾阴虚、过量使用热性中药致肾阴虚证模型[22]。其中，甲状腺激素法和氢化可的松法复制的模型是研究肾阴亏虚动物模型中最常见的2种。

2.1 甲状腺激素法复制模型过量使用甲状腺激素类药物可以导致机体功能紊乱，产生多汗、急躁、心率加快等肾阴虚的症状，常被用于构建肾阴虚型不育模型[22]。酒蒸女贞子对甲状腺诱导的肾阴虚模型大鼠睾丸的氧化应激损伤具有明显的保护作用，该模型大鼠睾丸组织中SOD活性显著下降，MDA含量升高，同时睾丸等脏器指数明显下降，而女贞子生品及酒蒸品均能显著提高模型大鼠的睾丸组织及脏器指数，升高睾丸组织SOD活性并降低MDA含量[23]。六味地黄汤可显著促进甲状腺素致肾阴虚型生精障碍大鼠睾丸精子的生成，改善其精子质量，升高大鼠血清中FSH、LH、T、NO和NOS水平，对损伤的睾丸曲细精管具有明显的修复作用[24]。

2.2 氢化可的松法复制模型采用不同剂量的氢化可的松处理可分别用于构建肾阳虚和肾阴虚两类不同的动物模型[25-26]，其中大剂量的外源性氢化可的松可使机体呈现烦躁多动等现象，常被用于建立肾阴虚型不育模型[27]。研究补肾滋阴法对醋酸氢化可的松致肾阴虚型大鼠睾丸组织超微结构的影响发现，模型组大鼠睾丸曲细精管生精上皮变薄，生精细胞和间质细胞数量减少，在透射电镜下观察到模型组大鼠睾丸曲细精管上皮细胞结构松散，间质细胞内线粒体变性，且溶酶体增多；二地鳖甲煎给予治疗后可显著改善上述症状[28]，提示补肾滋阴药二地鳖甲煎能拮抗醋酸氢化可的松诱导的大鼠睾丸病理损伤。

3 肾精不足型

肾精不足型动物模型常表现为：体毛枯疏，弓背蜷缩，反应迟钝，倦怠嗜睡，易受惊吓，拥挤扎堆，进食量和饮水量减少，生长发育迟缓等。常用的造模方法包括雷公藤灌胃法、腹腔注射环磷酰胺法、羟基脲灌胃法、房劳加惊恐法、泼尼松灌胃法、腹腔注射地塞米松法、维生素D缺乏法、维甲酸灌胃法[29-34]。其中雷公藤多苷、环磷酰胺和房劳加惊恐法是研究肾精不足动物模型中最常见的3种造模方法。

3.1 雷公藤法复制模型长期使用雷公藤可对机体生殖系统产生明显的毒性，导致精子减少甚至造成机体不育，常被用来建立肾精不足型动物模型[7，35-37]。左归丸能够明显改善肾精不足型大鼠状态，提高睾丸组织脏器系数、精子浓度、精子存活率及前向运动精子百分率，升高血清FSH、雌二醇(estradiol，E2)、LH、T水平，调控大鼠睾丸中Bax、Bcl-2、细胞增殖相关基因(Ki67)、生精细胞因子受体(stem cell factor receptor，c-kit)和睾丸干细胞因子(stem cell factor，SCF)mRNA及蛋白表达，促进精原干细胞的分裂和增殖，抑制生精细胞凋亡[38-40]。提示左归丸对雷公藤多苷致肾精不足动物模型具有明显的保护及治疗作用。

五子衍宗丸能够显著降低肾虚不足模型大鼠血清中FSH水平，提高T、INHB、雄激素结合蛋白以及转铁蛋白的表达水平[41]，也能够显著提高睾丸组织中的精子数量、前向运动精子百分率及精子总活力，增加睾丸组织中波形蛋白、α微观蛋白的表达量，提高生精细胞的增殖细胞核抗原且降低生精细胞的凋亡率[42]。研究发现，五子衍宗丸能够提高大鼠睾丸组织中自噬相关蛋白(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)、溶酶体关联膜蛋白-2(lysosome-associated membrane protein-2，LAMP-2)的表达，增加自噬小体数目[43]，降低模型大鼠睾丸组织中线粒体呼吸链细胞色素C氧化酶亚基7a2(cytochrome c oxidase subunit 7a2，cox7a2)的mRNA和细胞外信号传导调控激酶(extracellular signal regulated kinase，EPK)磷酸化水平，显著升高支持细胞组成蛋白Claudin-11表达水平[44]。提示五子衍宗丸可通过修复支持细胞骨架蛋白，恢复支持细胞中的相关生物标志物水平，调控支持细胞线粒体自噬、线粒体能量代谢和血睾屏障，抑制生精细胞凋亡，进而改善生精功能。

强精片对不育症大鼠睾丸中FasL、ABP蛋白及紧密连接蛋白(Occludin)表达影响的研究发现，强精片能够提高Occludin蛋白表达，降低睾丸组织中FasL和ABP蛋白表达，修复睾丸生精微环境血睾屏障功能，改善生殖功能[45]，提高精液质量，升高血清T及连接蛋白(connexin43，Cx43)表达水平[46]，提示益肾活血利湿中药强精片可能通过调节血清T水平及睾丸中Cx43蛋白表达改善不育症大鼠的精液质量。

3.2 环磷酰胺法复制模型环磷酰胺可诱导各级生精细胞发生凋亡，常被用来建立肾精不足型动物模型[7，47-49]。研究发现，促育生精方可用于治疗环磷酰胺诱导的小鼠不育症，显著提高模型组小鼠睾丸组织中精子密度、精子活力，升高睾丸组织中特异性CREM(cAMP-responsive element modulator)激活因子、cAMP(cyclic adenosine monophosphate)反应元件结合蛋白、精子尾部鞭毛特异性钙通道蛋白(cation channel of sperm，CatSper)及其mRNA的表达水平，改善小鼠精子质量[50-52]。

五子衍宗方可显著提高小鼠睾丸质量、睾丸指数、睾丸内各级生殖细胞数量以及睾丸中Bcl-2蛋白表达，降低Caspase-3、Bax蛋白表达以及凋亡细胞的数量，证实五子衍宗方能显著减少环磷酰胺致雄性小鼠睾丸生殖细胞的凋亡[53]。五子衍宗方能通过下调肿瘤抑制蛋白(p-P53)和γ位磷酸化的组蛋白(γ-H2AX)的表达水平，显著减轻环磷酰胺致小鼠睾丸细胞DNA损伤[54]。黄精赞育胶囊能够通过升高细胞内(phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B，Pi3k-Akt)信号通路中的PI3K和增强精子运动能力的Catsper1蛋白表达，提高精子的质量[55]。

冬虫夏草可明显提升精子密度与活力，降低精子畸形率，提高睾丸中SOD与谷胱甘肽(glutathione peroxidase，GSH-PX)活性并降低MDA含量[56]，提示冬虫夏草可通过清除活性氧自由基，提高抗氧化能力以缓解环磷腺苷所致小鼠睾丸生精功能的损害。姜黄素可明显缓解环磷酰胺所致小鼠体质量、睾丸质量、附睾质量、精子数量的降低，还能显著降低睾丸组织中MDA含量，升高过氧化氢酶(catalase，CAT)、SOD、GSH和GSH-PX活性[57]，证实姜黄素可通过抑制睾丸氧化损伤，提高相关抗氧化物水平，改善环磷酰胺致小鼠的生殖功能损伤。

3.3 房劳加惊恐法复制模型研究补肾生精汤对房劳模型小鼠生精细胞的影响时发现，与模型组比较，补肾生精汤组可提高小鼠睾丸和附睾质量、睾丸精子密度及畸形率，升高血清T水平[58]，提示补肾生精汤能使房劳小鼠生精功能得到改善，提高生殖能力。加味金锁二仙饮可改善惊恐模型小鼠肾精不足症状，升高血清T、FSH、LH含量，升高SOD活性，降低MDA含量，改善睾丸的病理损伤，发挥其补肾填精的功效[59]。

4 讨论

中医证候动物模型是研究中药治疗少弱精症作用机制的重要方法之一。本文总结了近15年中药对肾虚证动物模型生殖功能方面的研究，研究人员从组织水平、细胞水平和分子水平等角度，探究了肾虚证的不育机制及中药治疗肾虚症的作用机理。其中包括中药对下丘脑-垂体-睾丸轴和精液常规指标的影响，对睾丸组织结构的改善，以及促进睾丸生精功能恢复等方面。首先，中药通过改善和调节下丘脑-垂体-睾丸的生殖性腺轴功能，分泌相关激素(包括LH、FSH、T、E2等)，进一步促进生精细胞、支持细胞和间质细胞三者间相互作用并产生精子。此外，中药还可以促进肾虚型动物模型睾丸组织中精原干细胞的分裂和增殖，抑制生精细胞的凋亡。参与增殖信号通路中的相关基因(Ki67、SCF、c-kit等)和参与凋亡途径的相关基因(Bax、Bcl-2、Fas、Fasl、Caspase-3等)在中药治疗肾虚型动物的过程中也发挥了重要的作用。氧化应激也在中药修复肾虚型动物中产生了重要影响，其中，与氧化还原相关的酶和代谢物包括SOD、CAT、GSH-PX、ACP、LDH、SDH和GSH等。

存在的问题及解决方案：①临床研究中辨证分型多样，目前还缺乏公认的分型标准。因此采用一些造模方式建立的肾虚证动物模型，其病理特征和相关的生理生化指标可能会难以区分，不具有典型性。同时，研究还发现采用同一种造模方式建立的动物模型，在建模的过程中也会出现不同的证型。如采用泼尼松对动物进行注射，早期会出现类似“肾阴虚”的特征，而到晚期则会出现类似“肾阳虚”的特点[60]。因此，需要建立规范、典型及公认的与中药学相关的动物模型。②现有的关于中药治疗的实验基础研究大多未进行深入的探索，致使其作用机制相对不明确。因此建议分别从基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学的不同层面进行实验研究。

综上所述，肾虚是中医理论体系中的重要证候之一，将中医药理论与现代生物学分析技术进行有机的结合，建立相关的不育症动物模型，进而发现与病理变化之间的联系，是研究中药治疗男性不育症作用机制的重要手段。虽然目前男性不育症的病因机理多不明确，且人与动物间的种属存在较大的差异。但是运用现代生物学技术手段分析中药治疗对生物体的影响，揭示DNA、RNA、蛋白质以及代谢物的功能及其相关规律，对肾虚的病因病机和药物对肾虚作用机制等方面的探索具有重要的意义。