宏基因组二代测序在疑难感染性疾病中的临床应用价值

韩思雨 综述 刘建华 审校

（河北医科大学附属河北省儿童医院呼吸二科，河北石家庄 050031）

感染性疾病是儿童常见疾病，病原诊断是其诊治中的关键环节。而常规病原检测方法耗时长、阳性率低，难以满足临床需求。目前，宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）在临床病原诊断中应用得越来越广泛，尤其是疑难感染性疾病。此技术可适用于脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、痰、全血等标本，其原理为采集样本后，利用mNGS将样本进行测序前处理，并进行核酸暴露，将病原体的核酸序列与指定的庞大生物数据库进行比对，实现对病毒、细菌、真菌、寄生虫及非典型微生物等的全面检测［1］。该文为mNGS在细菌、真菌、病毒、寄生虫等感染中的诊断优势和临床应用价值的综述，以便指导mNGS在临床诊断中更好地应用。

1 mNGS在细菌性感染中的应用

细菌是感染性疾病中常见的病原体之一。当感染严重时，细菌可播散入血引起脓毒症。因此，早期明确感染病原体极为重要，常见的病原体检测方法为涂片与细菌培养，此方法需要花费较长的时间才可得出结果，并且，因培养需要一定的培养条件，所以，覆盖病原体的范围并不广泛，对罕见细菌的检测阳性率较低。

mNGS在细菌感染诊断中发挥重要作用。Zhang等［2］在细菌性脑膜炎患者中，以血液或BALF培养与肺炎链球菌抗体检测结果作为参考标准，发现mNGS诊断细菌性脑膜炎的灵敏度、特异度分别为70.3%、93.9%，阳性预测值、阴性预测值高达81.4%、91.3%。Huang等［3］研究显示，在肺部感染性疾病中，细菌培养结果阳性率为17.54%，而BALFmNGS阳性率为42.11%，远远高于前者，其中最常见的病原体有结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）（n=19，26.39%）、铜绿假单胞菌（n=16，22.22%）、鲍曼不动杆菌（n=9，12.50%）和肺炎克雷伯菌（n=7，9.72%）。Xie等［4］研究发现在重症肺炎患者中，mNGS组28 d（16.7%vs 37.7%，P=0.008）、90 d病死率（16.7%vs 42.3%，P=0.002）显著低于未用mNGS组。Pan等［5］报道了1例误诊为结核性脑膜炎的病例，结核相关性检查及CSF培养均阴性，临床诊断为结核性脑膜炎，并给予抗结核治疗，患者并无好转，最终行CSFmNGS发现诺卡氏菌，根据结果更改治疗后，患者恢复意识，病情好转。以上研究［2-5］说明mNGS对细菌检测的阳性率、准确性较高。

MTB是一种特殊细菌，临床上常见MTB检测方法有：结核菌素纯蛋白衍生物试验、涂片抗酸染色、抗MTB抗体检测、MTB聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测、结核感染T细胞斑点试验和MTB培养等方法。这些方法都有各自的优点，但同时也有局限性。结核菌素纯蛋白衍生物试验因受外界条件影响（如卡介苗接种和非结核分枝杆菌感染）特异度较低；涂片抗酸染色因可使除MTB外的麻风分枝杆菌、非结核分枝杆菌等着色，肉眼很难分辨，具有一定的假阳性［6］；抗MTB抗体因所用的抗原为MTB，与非结核肺部疾病致病菌存在共有成分或有交叉的成分，其特异性及敏感性均较低；结核感染T细胞斑点试验不能完全鉴别潜伏性结核感染及活动性结核感染［7］，且操作复杂、价格昂贵［8］；MTB培养需要2～4周，时间较长［9］；MTBPCR的时效性优于传统培养，但只能用于结核病的诊断和鉴别诊断，不能作为疗效评估的指标等。

而mNGS检测的是病原体核酸序列，虽MTB是一种胞内致病菌，细胞外游离DNA少，核酸序列提取困难［8，10］，但有研究显示，mNGS在排除标本污染的前提后，若检测出至少1条属水平的病原体序列，那就具有临床意义［11］。有学者认为，尽管mNGS所检测出的MTB核酸序列少，但灵敏度较高。林爱清等［12］将疑似结核性脑膜炎患者的CSF进行细菌培养及涂片，同时行mNGS检测，发现mNGS灵敏度（58.8%）高于涂片及培养（29.4%），其特异度高达100%。Wang等［9］同样采集结核性脑膜炎患者的CSF，进行mNGS及传统方法检测（即培养、PCR、抗酸染色及Xpert MTB/RIF），同样也发现mNGS灵敏度（66.67%）高于培养（8.33%），若mNGS与其他4种传统方法相结合，检测阳性率将提高到95.65%。mNGS不仅对CSF的MTB检测灵敏度高，还对痰、BALF等标本的MTB检测具有重要意义。Jin等［8］发现mNGS（49.6%）与培养法（包括痰、BALF、肺组织及血液等）（35.2%）相比，前者对MTB检测的灵敏度更高，也具有高特异性（98.3%），mNGS与培养检测的一致性为56.8%，且mNGS在一些培养结果为阴性的样本中也检测到MTB序列，并且mNGS检测灵敏度不低于Xpert MTB/RIF检测法，可说明mNGS对于除CSF外的其他标本检测MTB的灵敏度仍较高。

当临床诊断为细菌感染病例，尤其为非胞内致病菌感染［13］且病情危重患者，适用于mNGS检测，应早期积极采集标本，行mNGS加以鉴别。在mNGS灵敏度较低的胞内致病菌中，MTB具有相对较高的灵敏度及特异度，因此，若有疑似诊断中枢神经、呼吸系统MTB感染时，有必要行mNGS辅助诊断。

2 mNGS在真菌性感染中的应用

真菌感染具有危害性强、无典型临床表现的特点，早期识别及诊治仍主要依靠实验室病原学的检查。

2.1 曲霉菌感染

曲霉菌常见的检测方法有：显微镜检查、真菌培养、(1,3)-β-D-葡聚糖检测试验（简称G试验）、血清半乳甘露聚糖抗原检测（简称GM试验）及PCR检测等，以上方法均有局限性。显微镜检查缺乏特异性，不能准确区分真菌的种类；真菌培养的敏感性较低，培养时间较长；G试验对于念珠菌等多种真菌感染均可表现为阳性，特异性差；GM试验因与其他真菌及β-内酰胺类抗菌药物所残留的青霉出现交叉反应可导致假阳性［14］。贾建超等［15］研究发现在培养法检测出的曲霉菌感染病例中，利用mNGS均能够检出曲霉菌；而在培养法未能检测出曲霉菌感染病例中mNGS仍可检测出曲霉菌，说明mNGS对真菌尤其曲霉菌的灵敏度较高；He等［16］报道了3例重症肺炎患者，经验性给予抗菌药物治疗效果欠佳，mNGS提示曲霉菌感染，调整抗感染治疗后，患者病情明显好转，体现了mNGS对曲霉菌检测的准确性。

mNGS检测曲霉菌灵敏度较高、检测时间相对较短，当感染病例中临床表现符合真菌感染时，若其他常规真菌检测结果阴性，而mNGS检测结果提示曲霉菌感染，我们不妨试着按mNGS的结果选择覆盖曲霉菌感染的抗真菌药物治疗。

2.2 隐球菌感染

有研究认为，mNGS检测对隐球菌感染的确诊具有一定临床意义，无论是在CSF还是BALF中，均能够早期识别隐球菌感染，并识别其种属分型［17-18］。而费笑非等［19］将检测隐球菌感染的4种方法学（墨汁染色、培养、胶体金免疫层析法及mNGS）进行对比，前3种方法的灵敏度依次为51.06%、79.31%、89.36%，mNGS的灵敏度（74.47%）相对不高，其中，未用抗真菌药物治疗的病例检出隐球菌的灵敏度较高（86.2%），而已用抗真菌药物治疗后测得的灵敏度较低（50.0%）。因此，mNGS对隐球菌的检出率较低，其原因可能为：（1）mNGS检测阈值方面：目前仍未有一个mNGS阈值阳性的规范化标准，来确定隐球菌感染，即可能感染本身就是隐球菌感染，mNGS也检测出了隐球菌，但因其检测序列不高，则以污染的背景菌为由将其排除；（2）标本方面：隐球菌本身细胞壁较厚，难以破壁，并且自取出标本后，需要经过较长时间才进行检测，此过程中还要经过多次冻融，对标本形成损害，再加上宿主细胞的干扰，可降低检出率。Ji等［20］发现，利用0.025%的皂苷来选择性地消耗人DNA，可提高隐球菌感染的检出率；（3）mNGS检测前应用抗真菌药物：有部分病例同上述研究［19］，取标本前已长期应用抗真菌药物治疗。

在临床中，若患者有发热、呕吐、头痛、脑膜刺激征等临床表现或有慢性咳嗽、咳痰及胸部影像学表现为真菌感染时，并且有家禽、鸟类接触史，疑似隐球菌感染者，可以使用mNGS鉴别，但鉴于mNGS对隐球菌检测的低灵敏度，故不应完全依赖于此。

3 mNGS在病毒性感染中的应用

病毒感染的临床表现形式各异，并且症状、体征较为典型。然而，病毒种类多，易变异，mNGS检测可无偏倚性，可检测出较多的病毒类型。Jerome等［21］在11例病毒感染患者中，利用血清抗体、鼻咽拭子等常规病毒相关检测，检测出5例病毒感染，然而，利用血mNGS检测出8例阳性，其中有常规检测未检测到的病毒。Carpenter等［22］在明确含有至少1种病毒的50例血浆中，利用定量PCR核酸检测与血mNGS检测，一致率为89.2%，而mNGS检测出而定量PCR未检测出的病毒有24种。刘龙群等［23］报道了1例血流感染登革病毒的病例，有皮疹、黏膜出血等表现，个人史及辅助检查均未见特殊表现，给予抗细菌和抗病毒药物治疗后效果欠佳，予血mNGS检测，显示登革热病毒阳性，与疾病预防控制中心检测结果一致。mNGS对病毒甚至罕见病毒，能够实现早期及时地辨别，有利于更早地切断传播途径，以及对患者进行更精准的治疗。

因此，mNGS对病毒的检测具有较高的灵敏度，可作为常见病毒检测的有效补充。然而，RNA病毒基因不稳定，更容易变异，种类更多，不易创建RNA基因文库。因此，临床中若有疑似RNA病毒感染病例时，如甲型流感病毒、乙型流感病毒等，不可依赖mNGS进行诊断。

对于mNGS的检测，仍有一些病毒是特别的，即无明显核酸的病毒，如西尼罗河病毒、水痘-带状疱疹病毒和神经梅毒等，mNGS检测效果不佳，原因在于以上病毒为小序列核酸病毒，而核酸序列小的病毒mNGS难以检测［24］。因此，有些病原体虽然核酸序列小，但仍存在，这就提示我们对于核酸序列小的致病原是否可以考虑降低mNGS阳性检测报告的门槛。

4 mNGS在罕见病原体感染中的应用

某些罕见病原体具有传染性强、毒力作用大的特性，需早期识别并及时治疗、阻断传播，否则将造成极大危害。然而，这些病原体利用临床上常用的检测方法并不能早期、有效地识别，mNGS在此起着巨大作用。

4.1 耶氏肺孢子菌感染

耶氏肺孢子菌在临床诊断中极其缺乏病原体诊断的金标准。G试验、血清乳酸脱氢酶升高虽然无明显特异性，但通常当此2项检测为阴性时，可作为肺孢子菌的排除依据。最近的研究［25］发现，血mNGS肺孢子菌的灵敏度（94.59%）及特异度（100%）均比G试验联合血清乳酸脱氢酶（灵敏度89.19%，特异度56.0%）高，尤其是特异度。Wu等［26］通过mNGS检测出29例耶氏肺孢子菌感染的患者，其中仅有8例通过Wright-Giemesa染色涂片检测到。Xiao等［27］报道1例急性造血功能衰竭患者肺部感染耶氏肺孢子菌，在mNGS检测之前利用传统病原学方法未检测出任何重要的病原，利用mNGS提供了有力的感染依据。

4.2 军团菌感染

尿抗原检测和血清抗体检测对于军团菌来说，特异性较高，但前者无法精确检测出军团菌的分型，后者却需要数周时间进行血清抗体转化。而杜秀芳等［28］、Huang等［29］报道了利用mNGS检测出军团菌的病例，分别在BALF、关节液中检测出不同分型的军团菌，前者为嗜肺军团菌，后者为米克戴德军团菌。因此，mNGS不仅能够短时间内检测到军团菌的存在，而且也可检测出其感染病原体的分型。

4.3 鹦鹉热衣原体感染

Gu等［30］、Chen等［31］均报道了在鹦鹉热衣原体肺炎的病例中，常规病原体检测方法难以检出，而利用BALFmNGS检出鹦鹉热衣原体，从而减少诊断的延误，及早采用精准的抗感染治疗。

4.4 钩端螺旋体感染

Wilson等［32］报道了1例患有严重免疫缺陷的14岁患儿，在4个月内反复发热、头痛、抽搐，而常规的检测甚至包括脑活检等检查均未查出感染病原体，利用mNGS在CSF中检测到钩端螺旋体之后，根据mNGS结果采取治疗1月余后基本痊愈。

mNGS检测时间短，能够迅速精准地检测出某种罕见病原体的感染，为明确感染病原体提供一个较为准确的方向，尽早采取正确的诊疗措施，减少病情迁延及治疗拖延带来的不必要的伤害，甚至可能省去包括活检在内的有创检查。

5 mNGS的应用价值

（1）在混合感染方面，因其无偏倚性，多种病原体的检出率高于常规培养及涂片、PCR等检测，可检测出常规无法测得的其他病原体甚至罕见病原体［15，25，33］；（2）特异度普遍较高，准确性也相对较高；（3）mNGS在检测细菌、病毒、真菌及其他病原体时，相对于传统方法而言，可检测出病原体的分型；（4）mNGS检测时间短于传统培养。

6 mNGS的局限性

（1）在mNGS中，检测病原体并没有一个统一标准的阈值，易导致不同人做出的试验，其阳性率不同［15］；（2）mNGS既可检测病原体的DNA序列，也可检测RNA序列，只有二者同时检测，方可全面检测出患者所感染的病原体。然而，因mNGS检测价格昂贵，临床医师会根据患者的临床表现、实验室指标、影像学诊断及经验性治疗，来决定是否应用mNGSDNA检测、RNA检测。因此，在临床上可能会出现仅仅行mNGSDNA检测，而未作mNGSRNA的检测，从而漏检了某些感染病毒，此将会影响该技术的检出率［33］；（3）mNGS仍存在一定的假阳性、假阴性；（4）mNGS并不是测序数量越大，其为致病病原体的可能性越大，也要与临床表现、经验性治疗及常规病原学检测相结合，来决定所得出的病原体是否具有真正的致病性［27］。

7 展望

对于各个系统感染性疾病的诊断，mNGS技术仍是一个未来发展的方向。目前，mNGS在感染性疾病诊断中已经起着相当重要的作用，尤其对于罕见病原体感染，但mNGS仍有很多方面需要进一步完善与提高，如对不同感染病原体的序列诊断阈值标准的确定、耐药菌基因的检测及背景菌与致病菌的鉴别等。相信随着mNGS技术的提高，这一系列问题将被慢慢地攻克，使得此技术更准确、更广泛地应用于临床感染性疾病中，以帮助临床医师采取更精准的治疗，缩短病程，减少患者痛苦。