血小板胞外囊泡在脓毒症中的作用

黄佳南， 张媛莉

脓毒症是由多种细菌等病原体感染入侵人体而引起各种生化、生理及病理异常的综合症，其发病率和病死率较高[1]。有研究[2]发现，血小板胞外囊泡在脓毒症中发挥不可替代的作用，被建议作为脓毒症的生物标志物。本综述将从血小板胞外囊泡参与脓毒症的炎症反应、凝血功能障碍、心肌损伤等多方面进行阐述，旨在进一步明确血小板胞外囊泡在脓毒症的作用机制，并为脓毒症的治疗提供一定的参考和依据。

1 血小板与脓毒症

在脓毒症的发生、发展中，血小板扮演着重要的角色。随着脓毒症促炎及促凝机制的发生，血小板是最先反应的细胞之一[2]。血小板是由巨核细胞脱落形成的无核细胞碎片，作为最小的血细胞在健康个体的数量为(100～300)×109/L。血小板膜上表达着与炎症、免疫相关的分子，包括补体受体、黏附分子、各种受体及与其他细胞相互接触所必需的介质，这些结构决定了其重要功能[3]。在从巨核细胞脱落后，血小板在循环中存在5～7天，主要作为止血和血栓形成的调节剂。在正常情况下，血管损伤后，血小板在血液中被激活，黏附于内皮下暴露的细胞外基质上，形成血小板血栓，最终与纤维蛋白等组成完整的血栓[4]。但目前关于血小板在脓毒症中发挥的作用仍有异议，有部分研究[5-6]认为，血小板会加重炎症反应。也有研究[7-8]表明，血小板在脓毒症中能够抑制炎症的发生、发展。还有大量研究[9-10]证实，血小板胞外囊泡能够通过不同机制参与到对固有免疫的调控中，进一步控制脓毒症炎症的发生。

2 血小板胞外囊泡

细胞外囊泡(extracellular vesicles)是从细胞质膜(微囊泡或微粒)或细胞内体区室(外泌体)释放的膜囊泡[11]。由于文献中对术语的使用不一致，且难以证明特定的生物发生途径，现今细胞外囊泡是一个总称，涵盖细胞释放的各种亚型膜结构，包括微囊泡、微粒、外泌体、肿瘤小体、凋亡小体和许多其他名称[12]。血小板胞外囊泡含直径30 nm 至1 μm 的球形细胞外囊泡、1～5 μm长的管状细胞外囊泡，主要存在于外周血液中，在血小板活化、炎症反应、细胞凋亡时其数量增加，但因刺激因素的不同，所释放的血小板胞外囊泡的类型会有所差异[13]。血小板胞外囊泡充当多种功能分子，包括信号介质、生长因子、脂质、蛋白质、核酸等，它们介导细胞间合作、免疫反应、炎症反应和修复等[14]。

3 血小板胞外囊泡与脓毒症

3.1血小板胞外囊泡参与脓毒症的炎症反应

在脓毒症中，活化的血小板能够诱导对感染的急性期反应[6]。血小板的细胞质中含有致密颗粒、α颗粒和溶酶体。致密颗粒含有钙离子(Ca2+)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)等。而α颗粒则含有凝血酶、血管性血友病因子(VWF)、P选择素(P-selectin)、生长因子、趋化因子，且α颗粒的形成与人类的疾病状况相关[15-16]。这些颗粒、信号分子、蛋白质部分被组装包裹形成血小板胞外囊泡。在活化激动剂(如ADP、凝血酶、血栓素A2等)通过G蛋白偶联受体或其他受体结合时，通过Ca2+/蛋白激酶C(PKC)通路磷酸化可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)后，血小板分泌胞外囊泡来释放各种分子，进一步促进血小板活化、黏附、聚集和分泌，形成瀑布效应，放大炎症反应[17]。而在脓毒症中脂多糖(LPS)通过与血小板上Toll样受体(TLR)4结合后，激活蛋白激酶B(Akt)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，促进血小板胞外囊泡的分泌上升，使释放的白细胞介素(IL)-1β等炎症因子增加[18]。此外，脓毒症中葡萄球菌超抗原样蛋白5(SSL5)能够诱导血小板胞外囊泡通过单核细胞中CD40/肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路激活单核细胞表达和释放炎症介质，包括IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)，且呈剂量和时间依赖性[19]。

与此同时，这些血小板胞外囊泡也参与到与其他炎症细胞的调节中，如中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等，促进炎症细胞的募集，诱导炎症细胞活化、分泌和黏附等[20]。Sung等[21]实验发现，细胞外囊泡通过C型凝集素结构域家族5成员A(CLEC5A)/TLR2途径诱导中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成和促炎细胞因子释放，增强登革热病毒诱导疾病的致死率。Chimen等[22]从血小板衍生的细胞外囊泡中提取出血小板膜糖蛋白Ibα(GPIbα)，并发现GPIbα支持单核细胞在全身炎症中的募集。French等[23]发现，血小板衍生的细胞外囊泡在炎症期间浸润并改变骨髓，从而参与到免疫反应中。值得一提的是，血小板胞外囊泡在活化和凋亡时从血小板中释放出具有特异性的膜表位，这些分子在脓毒症中可以作为个体化治疗标志物[24]。

3.2血小板胞外囊泡参与脓毒症的凝血功能障碍

由于大量炎症细胞和炎症因子激活凝血级联反应，导致大量血小板被消耗，血栓形成，最终形成凝血功能障碍[25-26]。血小板胞外囊泡是凝血系统调节的重要组成部分，具有促凝的特性[27]。血小板胞外囊泡的凝血能力大约是单独血小板的50～100倍，其凝血能力的增加是由于翻转酶在活化状态下导致血小板胞外囊泡表面上的磷脂酰丝氨酸表面积增加。Reddy等[28]使用成像流式细胞仪技术观察到在活化状态下具有胞外囊泡的血小板表面上暴露出大面积磷脂酰丝氨酸。Meijden等[29]发现，来自血小板和红细胞的胞外囊泡不仅通过暴露磷脂酰丝氨酸促进凝血，而且还以凝血因子XⅡ(FXⅡ)依赖性方式独立于组织因子(TF)，启动凝血酶生成。Lopez等[30]使用大鼠失控出血模型来评估血小板胞外囊泡的促凝效果，发现凝血酶生成速率和数量以及整体凝块强度与血小板胞外囊泡的剂量存在依赖性增加的关系，且出现血压上升、乳酸水平降低、碱过量下降和血浆蛋白浓度增加等结果。

此外，血小板胞外囊泡的促凝作用不仅涉及促凝表面积的增殖，而且与损伤部位不同细胞参与者的交联和转移其他细胞类型的激活信号相关[31]。Gasecka等[32]通过使用P2Y12拮抗剂及P2Y1拮抗剂，抑制P2Y1和P2Y12受体，导致血小板聚集减少，并使血小板胞外囊泡的释放量下降。而血小板活化后，在血小板表面表达P选择素，并与免疫循环细胞表面所表达的P选择素糖蛋白1(PSGL-1)相结合，从而促使单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞向活化的内皮细胞募集、滚动及黏附，促进血栓形成[33]。Ssmajo等[34]发现，活化蛋白质S和凝血因子V是抑制因子Ⅷa的协同辅助因子，而活化的蛋白C系统具有抵抗血小板胞外囊泡促凝能力的功能。血小板胞外囊泡的促凝功能加重了脓毒症创伤，甚至导致弥散性血管内凝血(DIC)的发生，这是脓毒症最严重的并发症之一。Ohuchi等[35]收集患者的基础临床资料，分析血小板胞外囊泡的分泌水平与住院病死率或DIC之间的关联，发现血小板胞外囊泡与DIC具有相关性，但与住院病死率无关。Wang等[36]通过构建盲肠结扎穿刺法(CLP)脓毒症小鼠模型，发现血小板胞外囊泡是磷脂酰丝氨酸暴露和激活内源性和外源性凝血途径的总凝血酶(TG)的有效诱导剂，能够调节脓毒症凝血酶的产生，加重凝血功能障碍，促进DIC的发生。

3.3血小板胞外囊泡参与脓毒症的NETs形成 NEFs是一种基于染色质的网状结构，可释放到细胞外环境中以帮助清除病原体，但它们也与导致组织损伤、自身免疫增强和血管内血栓形成的过度炎症有关[37]。在脓毒症期间，LPS能够通过与血小板表面表达的TLR4相结合，以诱导血小板与中性粒细胞黏附，从而促使NEFs的形成[38]。在脓毒症期间，NEFs通过提供高浓度的抗菌分子对细菌的隔离和杀灭，从而介导宿主的免疫防御[39]。尽管参与人血小板介导的NETs生成的介质和分子途径仍不明确，但仍有证据表明，血小板胞外囊泡参与到脓毒症中的NETs形成。Mcvey等[40]假设来自于血小板和神经酰胺依赖性的细胞外囊泡形成诱导了输血相关性急性肺损伤，且列举了小鼠血小板储存过程中形成的细胞外囊泡，并将其应用于小鼠输血相关性急性肺损伤模型和体外内皮屏障评估，以此证明血小板细胞外囊泡通过鞘脂变阻器失衡介导输血相关的急性肺损伤。Jiao等[41]通过将健康对照者和感染性休克患者的血浆分离获取外泌体，再将获取的外泌体、磷酸盐缓冲盐水(PBS)及LPS刺激人血小板后获取的上清液与多形核中性粒细胞(PMN)共培养，发现外泌体高迁移率组蛋白1(HMGB1)和(或)微小RNA(miR)-15b-5p和miR-378a-3p，通过Akt/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)自噬途径诱导NETs形成，结果表明，IκB激酶(IKK)控制感染性休克中血小板衍生的外泌体分泌。

3.4血小板胞外囊泡参与脓毒症的心肌损伤

脓毒症心肌病是脓毒症患者常见的并发症之一，但脓毒症心肌病的定义仍有异议[42]。脓毒症产生的活性氧(ROS)将激活血小板，释放含有高水平烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的外泌体，这些外泌体增加内皮细胞内的一氧化氮(NO)与ROS，这将导致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3级联反应的激活，促使内皮细胞凋亡的发生。Monteiro等[43]发现，在脓毒症中血小板通过ROS激活后，将含有高浓度的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的外泌体在心脏血管中释放，而这些外泌体被内皮细胞活化，最终导致内皮细胞死亡和心脏功能障碍。此外，Azevedo等[44]通过实验发现，来自脓毒症患者的循环血小板衍生外泌体在离体心脏和乳头肌制剂中诱导心肌功能障碍，并且这种现象因LPS刺激而增强。

另一方面，血小板外泌体中含有miR-223，能够下调内皮细胞内的细胞间黏附分子1(ICAM1)、转录激活因子3(STAT3)、信号素3A(Semaphorin)及心肌细胞中的TNF-α、IL-6和IL-1β，从而减少内皮细胞损伤和保护心肌。Li等[45]通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测脓毒症患者的miR-132和miR-223，发现miR-132联合miR-223对脓毒症诱发的心肌病预后的敏感性及特异性分别为85.96%和65.22%，miR-132联合miR-223可用于心肌病的早期诊断和预后评估。Wang等[46]通过盲肠结扎穿孔构建脓毒症小鼠模型，发现相较于miR-233-KO的小鼠，野生型小鼠的胞外囊泡具有更高水平的miR-233，可将其传递至心肌细胞，导致信号素3A和STAT3下调，减少炎症反应和心肌细胞死亡。

综上所述，血小板来源的胞外囊泡在脓毒症中发挥着重要作用，不仅能够调节炎症反应和凝血功能障碍，而且可以协助NETs的形成，甚至可以减轻脓毒症心肌病损伤，是具有一定潜力的脓毒症治疗靶点[47-48]。当然脓毒症发病机制复杂，仅针对血小板胞外囊泡治疗脓毒症无法达到最佳疗效，未来还需探索更多的治疗脓毒症的新方案，更好地服务于人民大众。