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6 种结核分枝杆菌检测方法在不典型肾结核早期诊断中的应用价值比较

2022-11-15李崇斌尹航方鹏朱晓黎刘建震范正超

国际流行病学传染病学杂志 2022年3期
关键词:结核菌预测值结核

李崇斌 尹航 方鹏 朱晓黎 刘建震 范正超

1 河北省胸科医院泌尿外科, 石家庄 050041;2 河北省胸科医院分子生物实验室, 石家庄 050041

近年来, 虽然全球结核病的发病率已趋于稳定,但不典型肾结核发病增多,且易误诊或漏诊,一些患者甚至出现由于长期误诊、误治导致肾功能衰竭等严重后果。 提高不典型肾结核的早期诊断水平,有助于避免或减少手术,改善预后。 本研究回顾性分析了在河北省胸科医院就诊的不典型肾结核患者与非结核肾病患者的病历资料,探讨结核感染T 细胞斑点(T-SPOT.TB)检测与利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(GeneXpert MTB/RIF)检测在不典型肾结核诊断中的应用价值, 旨在为不典型肾结核的早期诊断提供参考,现报告如下。

对象与方法

一、研究对象

纳入 2015 年 10 月至 2020 年 12 月在河北省胸科医院泌尿外科住院诊治的46 例不典型肾结核患者 (结核组)、53 例未感染结核的肾病患者 (对照组)。 所有患者入院后常规进行结核菌素试验(PPD试验)、静脉血 T-SPOT.TB 检测、HIV 抗体检测,尿沉渣抗酸杆 菌 染 色 镜检 (AFB 镜 检法)、BACTEC MGIT960 液体培养 (液体培养法)、 结核分枝杆菌DNA 实 时 荧 光 定 量 PCR (TB-DNA FQ-PCR)、GeneXpert MTB/RIF 检测。 本课题研究已通过河北省胸科医院伦理委员会审批 (审批号:2021007),所有患者均知情同意。

二、纳入标准及排除标准

不典型肾结核的临床诊断标准: 没有典型的严重尿频、尿急症状,仅以轻微的尿频或以血尿、腰痛为主要表现,甚至无任何临床症状,只有影像学的一些改变,以尿结核菌培养有结核分枝杆菌生长或结核分枝杆菌核酸检测阳性或经肾组织病理检查为确诊肾结核的“金标准”。

排除标准:患有恶性肿瘤、严重营养不良、接受甾体类激素或免疫抑制剂治疗、放射治疗及艾滋病等全身免疫缺陷等疾病。

三、主要试剂及仪器

结核菌素纯蛋白衍生物购于北京祥瑞生物制品有限公司。 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫斑点法)购于广东希格生物科技有限公司。抗酸染色试剂5%的石炭酸复红液,5%的盐酸乙醇液,稀释美兰购于珠海贝索生物技术有限公司。7600 型实时荧光定量检测系统购于达安基因有限公司,分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR 荧光探针法,国械注准20173401341)购于成都博奥晶芯生物科技有限公司。 BACTEC MGIT960 分枝杆菌培养基(国械注进20142405711)购于碧迪医疗器械(上海)有限公司。 全封闭耐药检测系统(GeneX-pert 系统,型号GX-XVIR2)购于美国赛沛公司。

四、检测方法

1.样本采集

连续3~5 次无菌留取第一次新鲜中段晨尿,每次30~40 mL,送抗酸染色、结核菌培养、TB-DNA FQ-PCR 及 GeneXpert MTB/RIF 检测。 肝素抗凝管采集周围静脉血5 mL,行T-SPOT.TB 检测。

2.PPD 试验

按照结核菌素纯蛋白衍生物药品说明书及操作规范进行 PPD 试验,72 h 观察结果。

在桩基础施工过程中最为关键的施工工序就是放线定位,通过定位之后需要对钻机基本特点进行分析,然后选取最佳施工位置。在不影响成孔质量前提下进行拴桩,拴桩中需要合理应用十字交叉法进行质量检查,然后根据实际情况进行补桩和复测[1]。

3.T-SPOT.TB 检测

按照试剂盒说明书操作及判定结果,阳性结果表明样本中存在针对结核分枝杆菌特异的T 细胞。

4.AFB 镜检法

取新鲜晨尿 1 mL,3 000 r/min 离心 15 min (离心半径7 cm),弃上清,留沉渣涂片,固定,抗酸杆菌染色,镜检。 按照《结核病诊断细菌学检验规程》检测及判定结果。

5.结核菌培养

取新鲜晨尿2 mL 按 《结核病诊断细菌学检验规程》行结核菌培养及判定结果,结核菌培养阳性者加行药敏试验。

6.TB-DNA FQ-PCR 检测

取无菌留取的新鲜晨尿1 mL,12 000 r/min 离心5 min(离心半径7 cm),留取沉淀,加入1 mL 无菌生理盐水洗涤1 次,8 000 r/min 离心5 s (离心半径7 cm)留取沉淀,加入 50 μL DNA 提取液混匀,100 ℃恒温干浴 10 min,4 ℃冰箱冷却后,8 000 r/min 的速度离心5 s (离心半径7 cm)待用。 取标准品、阴性、阳性质控品各1 mL,8 000 r/min 离心5 s (离心半径7 cm)。 取阴性和阳性质控品各50μl 加等量已混匀的 DNA 提取液混匀,100 ℃恒温干浴 10 min,4 ℃冰箱冷却后,以8 000 r/min 的速度离心5 s (离心半径7 cm),待用。把处理过的样本、标准品、阴性质控品、阳性质控品分别吸取上清2 μL 加入反应管中,8 000 r/min 离心 5 s(离心半径 7 cm),置入 7600 型实时荧光定量检测系统,按预设程序进行扩增和分析,记录结果。扩增循环数(Ct 值)<40 为阳性,>40 为阴性。

7.GeneXpert MTB/RIF 检测

严格按试剂盒的说明书操作,取无菌留取的新鲜晨尿15 mL,以6 000 r/min 的速度离心20 min(离心半径 7 cm),留取沉淀 2 mL,标配处理液 1∶2 比例混合,旋紧管盖,用力振荡 10~20 次,静置 5~10 min 时再次用力振摇 10~20 次,再室温静置 5~10 min。样本充分液化,无未液化的沉渣。 吸取2 mL 样本至Xpert反应试剂盒,置于GeneXpert 检测系统自动化检测。

五、统计学方法

采用SPSS23.0 软件进行数据分析,计量资料通过K-S 检验进行正态性检验,符合正态分布的计量资料用表示,计数资料采用百分比表示,两配对样本率的比较(灵敏度、特异性)采用McNemar 检验,两独立样本率的比较(阳性预测值、阴性预测值和准确度) 采用Pearson 卡方检验或Fisher 确切概率法。 P<0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

一、两组患者临床资料的比较

结核组中, 男性 25 例 (54.35%), 女性 21 例(45.65%),年龄(42.7±9.8)岁,范围 21~66 岁,左肾结核 22 例(47.83%),右肾结核 23 例(50.00%),双肾结核1 例 (2.17%)。 患者主要症状为轻微尿频23 例(50.00%),体检发现肾积水或伴有肾实质损害14 例(30.43%),患侧腰部酸胀不适 5 例(10.87%),血尿 4例(8.70%)。 泌尿系彩超或CT 检查发现不同程度的肾积水:轻度 38 例,中度 7 例,重度 1 例。 对照组男31 例(58.49%),女 22 例(41.51%),年龄(40.7±10.5)岁,范围 23~75 岁,单纯性肾囊肿(直径>4 cm)18 例(33.96%),慢性肾盂肾炎 15 例(28.30%),肾盂旁囊肿4 例(7.55%),肾盂输尿管连接部梗阻伴肾积水13 例(24.53%),肾错构瘤(直径>4 cm)3 例(5.66%)。

结核组患者经尿液BACTEC MGIT960 液体培养阳性或结核分枝杆菌核酸检测阳性或肾组织病理学检查确诊。 对照组患者经上述结核菌检测阴性排除肾结核, 且术后病理结果与术前诊断相符,慢性肾盂肾炎经抗感染治疗治愈。

二、不同方法的检测结果比较

由表1 可见,T-SPOT.TB 的灵敏度为95.65%,高于 PPD 试验(73.91%,McNemar 检验:P=0.002),两者特异性(McNemar 检验:P=0.250)、阳性预测值(χ=0.12, P=0.729)、准确度(χ=1.09, P=0.296)均无差异,T-SPOT.TB 阴性预测值为 95.74%, 高于PPD 试验(80.00%),差异有统计学意义(χ=5.75,P=0.002)。

表1 不同结核分枝杆菌检测方法的结果比较(%)

注:PPD 试验:结核菌素试验;T-SPOT.TB:结核感染T 细胞斑点试验;AFB 镜检法:涂片抗酸杆菌染色镜检法;TB-DNA FQ-PCR:结核分枝杆菌DNA 实时荧光定量PCR;GeneXpert MTB/RIF:利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术

方法 灵敏度 特异性 阳性预测值 阴性预测值 准确度PPD 试验 73.91 90.57 87.18 80.00 82.83 T-SPOT.TB 95.65 84.91 84.62 95.74 89.90 AFB 镜检法 4.35 94.34 40.00 53.19 52.53液体培养法 28.26 100.00 100.00 61.63 66.67 TB-DNA FQ-PCR 58.70 96.23 93.10 72.86 78.79 GeneXpert MTB/RIF 84.78 100.00 100.00 88.33 92.93

GeneXpert MTB/RIF 检测灵敏度为84.78%,高于TB-DNA FQ-PCR (58.70%)、 结核菌液体培养法(28.26%) 和 AFB 镜检法 (4.35%)(McNemar 检验:P均<0.001)。 GeneXpert MTB/RIF 与液体培养法的特异性均为 100.00%,TB-DNA FQ-PCR 为 96.23%,AFB 镜检法为 94.34%,GeneXpert MTB/RIF 与三者的特异性均无统计学差异(McNemar 检验:P=1.000、0.500 和 0.250)。 GeneXpert MTB/RIF 与液体培养法的阳性预测值均为100.00%, 高于AFB 镜检法(40.00%,Fisher 确切概率法,P=0.001), 与 TB-DNA FQ-PCR 无统计学差异(93.10%,Fisher 确切概率法,P =0.178)。 GeneXpert MTB/RIF 的 阴 性 预 测 值(88.33%) 高于 AFB 镜检法 (53.19%,χ=20.42, P<0.001)、液体培养法(61.63%,χ=12.67, P<0.001)、TBDNA FQ-PCR(72.86%,χ=4.84,P=0.028),其准确度(92.93%) 高于 AFB 镜检法 (52.53%,χ=40.74,P<0.001)、 液体培养法 (66.67%,χ=21.18,P<0.001)与TB-DNA FQ-PCR(78.79%,χ=8.15,P=0.004)。

讨 论

不典型肾结核仅表现为轻微的甚至无任何临床症状,只有部分影像学改变。 本研究的临床资料显示,结核组的主要症状为轻微尿频、不明原因肾积水提示不典型肾结核的临床症状更加隐匿,且可能较早出现输尿管结核性梗阻而继发肾积水。如何提高不典型肾结核的诊断水平,应当引起高度重视。

一、T-SPOT.TB 在不典型肾结核筛查中有较高的应用价值

PPD 试验与T-SPOT.TB 均为辅助诊断和筛查结核病及结核分枝杆菌潜伏感染较为有效和敏感的方法。 本研究结果显示,T-SPOT.TB 的灵敏度(95.65%)和阴性预测值 (95.74%)高于PPD 试验,与现有报道相似,但两者特异性、阳性预测值和准确度无显著差异。究其原因,可能是由于T-SPOT.TB是通过检测血液样本中每个活化的结核特异效应T细胞数(即显色的斑点数)来判断结核分枝杆菌感染状态,灵敏度极高,而PPD 试验属于Ⅳ型超敏反应,需要测量和观察皮肤的硬结和局部反应判断结果,易受局部炎症因子浓度、皮肤病变、环境温度、测量误差等多种因素影响,导致T-SPOT.TB 灵敏度高于PPD 试验。 另外,T-SPOT.TB 在 36~48 h 即可报告结果,而PPD 试验一般需要48~72 h。 因此,在不典型肾结核的筛查诊断中,T-SPOT.TB 较PPD 试验具有更高的灵敏度和应用价值。

二、GeneXpert MTB/RIF 在不典型肾结核病原学诊断中有较高的应用价值

肾结核的病原学诊断包括抗酸染色(AFB 镜检法)、结核菌培养以及结核菌DNA 检测,以尿结核菌培养为“金标准”。 AFB 镜检法无法区分结核分枝杆菌和其他抗酸杆菌,如包皮杆菌等。 尿结核分枝杆菌DNA 检测虽然对尿结核分枝杆菌具有较高的特异性和灵敏度,但当肾自截、肾无功能或输尿管梗阻导致结核菌无法随尿排出及DNA 被污染或发生变性时,可出现假阴性和假阳性结果。 另外结核菌能自发或经理化、生物因素诱导形成L 型结核分枝杆菌, 可导致临床症状不典型、PPD 试验不敏感、 抗酸染色不能检出等后果。 本研究显示,GeneXpert MTB/RIF 的灵敏度(84.78%)、阴性预测值(100.00%)和准确度(92.93%)均高于 TB-DNA FQ-PCR、 液体培养法和AFB 镜检法, 证实了Xpert检测结核分枝杆菌具有高度的灵敏度和准确性,且具备较高的阴性预测诊断价值。 GeneXpert MTB/RIF 与BACTEC MGIT96 液体培养法的特异性和阳性预测值均为100%, 两者特异性与TB-DNA FQPCR 和AFB 镜检法无统计学差异,而阳性预测值高于AFB 镜检法, 与 TB-DNA FQ-PCR 无统计学差异。 分析原因可能为:(1) 对样本的含菌量要求不同, 理论上,AFB 镜检法检查样本含菌量需5×10~5×10/mL,结核菌培养需 100/mL,TB-DNA 检测只需样本中含有1 根结核菌即可, 少于此数时不易获得阳性结果;(2)结核菌培养要求样本中含有存活的可繁殖的结核菌,而且生长缓慢,条件苛刻,耗时长,需要 4~8周;(3)TB-DNA FQ-PCR 与 GeneXpert MTB/RIF 虽然都采用实时荧光定量核酸扩增技术, 但由于操作设备灵敏度、密闭条件和检测样本量的不同(15 mL 和 1 mL), 造成两者灵敏度的差异。 因此,GeneXpert MTB/RIF 在不典型肾结核的病原学诊断中具有更高的灵敏度和应用价值。

三、结语

本研究发现T-SPOT.TB 与GeneXpert MTB/RIF在不典型肾结核的筛查和病原学诊断中有较高的灵敏度和应用价值,推荐临床应用。 但由于研究对象数量有限,有待扩大样本量进行大型、多中心的前瞻性研究。 目前部分有条件的科研和临床研究中心已经开展了更先进的Xpert MTB/RIF Ultra, 进一步提高了检测灵敏度, 但其特异性稍低于GeneXpert MTB/RIF,同时还探讨了如何使用现有设备条件促进Xpert MTB/RIF 的推广应用, 以上研究对临床上提高不典型肾结核诊治水平给予极大的信心。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

李崇斌:研究设计和实施,采集数据,分析和解释数据,撰写论文;尹航、朱晓黎、刘建震:实施研究,采集数据和分析;方鹏:分子生物技术指导和实施,范正超;论文审阅和工作指导

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