结直肠癌研究热点之肿瘤异质性研究进展

胡 邦，任东林

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的恶性肿瘤之一，世界卫生组织(World Health Organization,WHO)发布的最新报告显示，全球CRC总体发病率、死亡率分别上升至第三位和第二位。到2020年，CRC占全球新发癌症病例的10%(190万)和死亡病例的9.4%(90万)。遗传因素和环境危险因素在CRC的发生发展中都起着重要作用，家族遗传背景主要影响个体患病风险，而环境因素，包括饮食和生活方式，影响人群的发病率。仅10%～20%的CRC患者有阳性家族史，提示大多数CRC是散发性。根据世界癌症研究基金(World Cancer Research Fund，WCRF)/美国癌症研究所(American Institute for Cancer Research，AICR)持续更新的项目报告，吸烟、肥胖、低体力活动、西方饮食习惯和酒精增加了CRC发病风险。TNM肿瘤分期系统由美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)和国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC)共同制定，是目前临床对患者进行分层诊治最可靠的预后参数。TNM分期系统描述了肿瘤侵入整个肠壁的深度(T)、转移的淋巴结数量(N)和远处转移情况(M)。根据T、N和M分类将肿瘤分为4个不同的阶段，具有不同的预后和治疗结局。Ⅰ期CRC患者的5年生存率为94%，Ⅱ期CRC患者的5年生存率为82%，Ⅲ期CRC患者则下降至67%，而转移性或Ⅳ期CRC的5年生存率只有11%。CRC治疗策略高度依赖于诊断时的临床分期，手术被认为是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期CRC患者的一线治疗方法，术后Ⅲ期和合并高危险因素的Ⅱ期CRC患者追加辅助化疗。在Ⅳ期CRC患者中，可切除转移瘤CRC患者的治疗选择包括新辅助化疗、原发灶和转移灶切除术。如果存在广泛不可切除的转移病灶，主要行姑息性化疗或放射治疗缓解临床症状。尽管CRC的治疗在过去的20年里取得了明显进展，但是，即使在相同的TNM分期阶段，不同患者的生存率仍然有较大的差异。近10年来，研究人员认识到这些CRC患者预后的差异可部分用肿瘤生物学行为的差异来解释，CRC被认为是一种高度异质性和动态性的疾病，在整个肿瘤进化过程中通过多种分子途径表现出来。近年对CRC基因组差异表达和肿瘤异质性的认识，导致治疗方式向个性化用药的逐步转变。肿瘤异质性是近年来各类肿瘤研究的热点方向，可分为肿瘤间异质性和肿瘤内异质性。肿瘤间异质性包括患者之间相同组织学类型肿瘤的差异，更罕见的是发生在单个患者内的多原发CRC的差异。肿瘤内异质性可分为空间异质性和时间异质性。空间异质性是指在原发肿瘤部位内的不同亚群肿瘤细胞或原发肿瘤与转移病灶之间的差异；时间异质性是指CRC的动态进化性，随着时间的推移，瘤内肿瘤细胞发生基因改变。CRC的异质性研究已经在不同的细胞分子水平上进行了探讨，包括基因组学、转录组学、组织病理学特征和炎症浸润的特征。本文将概述CRC肿瘤间和肿瘤内异质性研究进展，并进一步探讨肿瘤异质性对治疗决策的影响以及不同生物标志物的预后价值。

1 肿瘤间异质性

CRC在组织病理、细胞分子不同水平上存在差异，导致预后和治疗反应不同，即使是具有相同TNM分期的CRC患者。这些差异需要我们进一步完善现有的分期系统，以便更好地指导CRC的治疗和预后预测。目前临床上常用的CRC诊断检查方案包括TNM分期、病理组织生物标志物分析和微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)分析。当CRC患者出现远处转移时，KRAS、NRAS和BRAF突变状态的确定是至关重要的，以优化治疗的选择和指导抗表皮生长因子受体的靶向治疗。

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肿瘤间组织病理学异质性 WHO根据CRC组织病理学表现定义了CRC的不同组织学亚型。如果观察癌组织中腺体的结构且没有过多的黏液产生，则肿瘤被评估为腺癌。当超过50%的肿瘤组织内产生黏液时，该肿瘤被评估为黏液腺癌。黏液性癌占所有CRC的10%左右，主要位于右半结肠，其MSI-H比例较高，且KRAS、BRAF和PIK3CA突变率较高。CRC黏液腺癌的预后目前存在一些争议，黏液腺癌最初被认为是CRC预后差的组织学类型。然而，当纠正术后TNM分期时，没有观察到腺癌和黏液腺癌患者的生存预后存在显著差异。印戒细胞癌是CRC少见的组织学亚型，占CRC比例不到1%。它的特征是印戒细胞的增殖，细胞内有黏液湖，将细胞核推向胞浆外周。印戒细胞癌通常在年轻患者中被诊断，在多达40%的病例中观察到其与右半结肠和MSI状态相关。印戒细胞癌在早期就容易转移到肝脏、腹膜和卵巢等多个部位，而腺癌的转移大部分只转移到肝脏。髓样癌是CRC另一种罕见的组织学亚型，每10万例CRC中仅有5～8例。髓样癌分化差，其特征是肿瘤细胞排列呈片状或巢状，上皮组织内大量淋巴细胞浸润，并罕见腺体形成。与黏液腺癌类似，髓样癌在右半结肠更为常见，并与MSI(高达60%的病例)和BRAF突变(约85%的病例)密切相关。髓质分化被认为是CRC的一个良好的预后标志物，髓样癌通常不发生壁外浸润和淋巴结转移。髓样癌中的淋巴细胞浸润促进了抗肿瘤相关炎症反应，从而防止肿瘤扩散和微转移的发生。不同的组织学亚型阐明了CRC组织病理学特征的异质性，对应不同的进化途径，并可预测治疗反应。虽然已经有一些研究探讨了不同组织学亚型对预后的预测价值，但很少有研究探讨其在治疗决策中的作用。此外，一些典型组织病理学特征，也有助于了解CRC的异质性和生物学行为。肿瘤出芽是肿瘤组织中常见的病理特征，其在20%～40%的CRC病例中观察到。肿瘤出芽被认为是肿瘤转移的第一步，出芽细胞被认为已经通过细胞外基质迁移，侵袭淋巴脉管组织，并在淋巴结或远处形成转移性肿瘤细胞集落。同时，肿瘤出芽与低分化簇的存在密切相关，这种现象可以预测CRC预后不良。然而，肿瘤出芽在预测治疗反应方面的作用尚未明确。

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肿瘤间分子异质性

1.2.1 发病机制的异质性 CRC的发生主要有3种途径：染色体不稳定性(chromosome instability,CIN)导致70%～90%的CRC；CpG岛甲基化表型(CpG island methylator phenotype,CIMP)导致10%～20%的CRC；错配修复基因突变(different mis-match repair,dMMR)。根据Fearon和Vogelstein在1990年提出的模型，大多数散发性CRC(约占85%)来自腺瘤癌变，它们的特征是CIN、阴性的CIMP、微卫星稳定性(microsatellite stable，MSS)以及KRAS突变和BRAF野生型基因。约15%的CRC起源于锯齿状腺瘤癌变，其途径以CIMP、MSI和BRAF突变为特征。MSI这类肿瘤中的一部分具有显著升高的基因突变率[高肿瘤突变负荷(tumor mutational burden,TMB)]，其特征是dMMR并MSI-H/L。左侧和右侧CRC肿瘤的不同来源导致不同的基因表达和突变谱，最终影响预后。右侧肿瘤显示出更高频率的BRAF突变和MSI，并倾向于发生在具有CRC遗传易感性的患者中。相反，左侧肿瘤的特征是CIN和涉及表皮生长因子受体通路激活的基因突变。此外，与左侧肿瘤相比，右侧肿瘤的突变数量明显增加。

1.2.2 MSI状态 MSI患者占CRC病例的15%，其特征是DNA错配修复( mis-match repair,MMR)系统存在缺陷，导致微卫星水平上的基因组不稳定。MMR系统的缺陷导致DNA修复不足，从而导致高水平的DNA复制错误。在散发性CRC，MSI肿瘤是通过MMR基因的高甲基化修饰，而在Lynch综合征患者，失活突变存在于MMR基因。MSI肿瘤通常位于右边结肠，伴有组织分化低，以及大量肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)浸润和肿瘤周围Crohn样反应。MSI肿瘤不太容易发生淋巴结和远处转移，是肿瘤预后良好的标志。

1.2.3 分子分型 在这个精准医学的时代，传统的肿瘤形态学分类不能完全体现CRC异质性，不能适应现代肿瘤治疗的需要。需要依据CRC的异质性特征进行分子分型，指导CRC的精准化治疗。2015年，CRC亚型联盟对这些数据集进行了联合分析和聚类分析，得到了4个具有独特特征的共识分子亚型(consensus molecular subgroups,CMS)，1个亚组缺乏特异性分子特征。CMS1，是一类以CD8细胞毒性免疫细胞浸润和高突变频率为特征的CRC；CMS2，是具有上皮标志物表达和Wnt通路激活的CIN肿瘤；CMS3，是一种同时包含MSI和MSS状态、高代谢活性和KRAS突变的CRC；CMS4，被称为间充质亚型，包括具有较高的间质含量和肿瘤生长的转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)，并且CMS4患者的总生存率最差。然而，仍有13%的CRC病例不能被分类，导致第5种亚型没有明确的分子特征。这表明需要进一步对CRC基因组和表观基因组分析，以增加对CRC生物学行为的了解，并获得更好的疾病分层。

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炎症异质性 越来越多的证据表明，CRC的发生发展不仅取决于肿瘤细胞本身的基因变化，还取决于肿瘤细胞和肿瘤微环境之间复杂的相互作用。肿瘤微环境由上皮细胞、血液、淋巴管、基质细胞和免疫细胞组成，其中起到重要作用的免疫细胞既可以通过识别并杀灭肿瘤细胞抑制肿瘤生长，也可以通过过度诱导肿瘤进展控制适应性免疫反应，刺激肿瘤细胞的增殖和存活，促进血管生成和转移。大量研究已经证明了MSI肿瘤被TIL高度浸润，这提示TIL可能是一个有益的预后因素。Galon等发现，相比目前CRC组织病理学分期，肿瘤组织中免疫细胞的分布和密度可以更好地预测患者的预后。该研究设计了基于肿瘤中心和周围T淋巴细胞(特别是细胞毒性T细胞和记忆T细胞)的定量免疫评分，同时该研究结果证明免疫评分是CRC患者的预后相关指标。近10年在肿瘤免疫学研究方面的进展也使CRC免疫治疗取得了巨大进步。免疫检查点阻断治疗(immune checkpoint therapy)是一个热门研究方向，这类药物的作用机制是通过解除肿瘤细胞对宿主的逃逸，进而促进宿主免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

2 肿瘤内异质性

肿瘤内异质性被描述为在一个肿瘤中存在不同的亚克隆现象，这种肿瘤内异质性与进化过程中产生了基因不同的亚克隆肿瘤细胞有关，也与肿瘤组织中完全分化的癌细胞和未成熟的癌症干细胞的共存有关。CRC内异质性主要表现为肿瘤内组织病理学异质性和肿瘤内分子异质性。

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肿瘤内组织病理学异质性 肿瘤内组织病理学异质性定义为一个肿瘤内包含2种或以上形态学肿瘤细胞混合生长的特征，如腺癌、黏液或髓质。与MSS肿瘤相比，MSI肿瘤组织病理学水平的异质性已被证明更为广泛。De Smedt等研究发现，超过50%的MSI肿瘤显示混合形态生长模式，这种混合形态的特征仅在10%的MSS肿瘤中可见。除了存在形态学生长模式外，在同一个肿瘤组织病理中还观察到炎症浸润(T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞)的变化。同样，与MSS肿瘤相比，这些差异在MSI肿瘤中更为常见，并且与肿瘤的形态学生长模式高度相关。

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肿瘤内分子异质性

2.2.1 原发肿瘤内分子异质性 Baisse等研究表明，在肿瘤内15～20个区域组织检测基因改变和杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)时，发现67%的晚期CRC存在肿瘤内分子异质性，这表明了肿瘤取样的重要性。在大多数研究中，当组织被福尔马林固定和石蜡包埋时，没有考虑到特定的组织区域图谱，因此无法分析肿瘤内特定位置之间的异质性。当考虑术前新辅助治疗时，方案制定通常是基于从肿瘤表面进行的抽样活检的状态，故有时会导致不恰当的治疗决定。因此，建议从肿瘤的不同部位至少进行2次活检，以避免取样错误导致没有准确地评估肿瘤内异质性。Suzuki等研究发现，在不同的CRC患者中，使用靶向二代测序(next generation sequencing,NGS)和三代扩增子测序观察到肿瘤内异质性的差异。在对4例CRC患者的24例标本的分析中，通过NGS发现不同的肿瘤区域在APC、KRAS和TP53等驱动基因突变情况高度一致。然而，进一步通过扩增子测序方法发现在原发肿瘤周围的亚克隆水平上存在大量突变，在MSI肿瘤中观察到更广泛的肿瘤内分子差异。

2.2.2 原发性肿瘤与转移瘤之间的分子差异 大多数情况下，原发性结直肠肿瘤和转移瘤的基因突变图谱是一致的。Brannon等证明了KRAS、NRAS和BRAF的突变分析结果显示，在原发肿瘤和转移组织中发现的结果完全匹配。这一发现也适用于其他驱动基因，如APC、TP53和PIK3CA。然而，数量远多于驱动基因的“乘客性”突变，常常在原发肿瘤和转移瘤之间产生异质性。在微卫星状态方面，Galon等也观察到原发肿瘤与其转移病灶之间的MSI状态的高度一致性，只有在有限数量的病例中观察到MSS转移与MSI原发肿瘤。由于散发性背景下的MSI是MMR基因的表观遗传沉默的结果，因此原发性肿瘤和转移瘤的MSI状态的差异是非常可能的。人们普遍认为，MSI在肿瘤的起始阶段很重要，而对肿瘤的进展并不重要。因此，MSI已经表现在癌症进展的早期阶段，这也解释了为什么在MSI原发肿瘤的转移中可见MSI的丢失。但迄今为止，在MSS肿瘤的转移过程中还没有观察到MSI的出现。

3 结语

CRC是一种高度异质性的疾病，因此，非常需要精准的疾病分层来区别肿瘤间和肿瘤内的异质性。在病理报告中总结MSI状态、TNM分期、淋巴管浸润、肿瘤出芽、肿瘤分化以及BRAF、KRAS、NRAS突变状态是很重要的。它们共同提供了疾病行为、疾病进展和预后的指示，并指导治疗决策。预计肿瘤免疫评分和分子分型将被添加到未来的病理报告中，进一步提供大量关于预后和对靶向、免疫治疗反应的信息。展望未来，伴随多区域和组学测序、单细胞测序以及纵向液体活检方法的广泛应用，我们在临床上对肿瘤异质性的评估将更加精确，进而促进更有效的CRC个性化精准治疗。