视网膜色素上皮细胞间连接完整性的新认识

韦嘉仪 综述 王方 审校

同济大学附属第十人民医院眼科，上海200072

视网膜位于眼球壁最内层，主要由视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞、感光细胞和Müller细胞组成。RPE完整性在维持视网膜功能中起着重要作用。RPE将神经视网膜与下层的Bruch膜及有孔的脉络膜毛细血管分开，并通过分隔脉络膜毛细血管形成血-视网膜外屏障(outer blood-retina barrier，oBRB)。同时以多种生理功能，如提供视网膜营养因子、维持维生素A视觉循环、吞噬光感受器脱落盘膜等支持和稳定神经视网膜的正常功能。RPE的这些重要作用均基于其细胞间连接的正常和稳定。近年，随着细胞分子生物学检测技术不断成熟和发展，重新认识RPE细胞间连接成为研究热点。大量研究发现，RPE细胞间连接异常是许多眼底疾病发生的基础或前奏，靶向保护RPE细胞间连接对于临床预防和治疗眼底疾病具有重要的意义。本文就RPE细胞间连接及其在眼底病变中的作用进行综述。

1 RPE细胞间连接

大量研究证实，RPE细胞间连接对于组装和维持细胞结构具有重要作用。超微结构下，RPE细胞间连接主要是紧密连接、黏附连接和缝隙连接。

1.1 紧密连接

紧密连接是上皮细胞和内皮细胞间黏附复合体，以紧密的膜接触形成膜内扩散屏障，维持细胞表面极性，限制脂质细胞膜内外的扩散。与其他上皮细胞不同，RPE的顶面与神经组织直接接触，参与感光细胞外节的日常吞噬作用。虽然目前对RPE内物质在细胞间运输的研究甚多，但对紧密连接复合体在健康和疾病状态中作用的研究甚少。

紧密连接是由一个复杂蛋白质网络组成的跨膜蛋白和胞浆蛋白在上皮细胞中的一种细胞-细胞连接，构成了上皮细胞两侧固有的一种屏障，阻止大多数可溶性分子渗透。早期通过冷冻断裂电子显微镜发现，紧密连接是以网状结构包绕在顶层膜周围。最近，通过制作非晶碳样品在透射电子显微镜下观察发现，紧密连接网状结构膜内的原纤维呈双链形态，这种双链结构的紧密连接更有助于未来细化分析其时序性变化。在组织结构上，紧密连接由完整的膜蛋白、细胞骨架蛋白和细胞质斑蛋白组成。这些蛋白包括Occludin、Claudins、细胞黏附因子、Tricellulin以及膜相关的鸟苷酸激酶家族支架蛋白，即封闭蛋白(zonula occludens，ZO)，包括ZO1、ZO2和ZO3。其中ZO蛋白包含一系列保守的蛋白-蛋白相互作用结构域，即PDZ、SH3和GuK，负责连接不同的黏附受体，例如Claudins及其细胞骨架。紧密连接是特殊结构，即通过形成一条闭锁小带完全包围单层上皮细胞，从而遮盖RPE细胞之间几乎所有的空间，以维持细胞极性，有效阻止血浆成分和有毒分子向视网膜移动，并允许液体和溶质通过渗透梯度从脉络膜脉管系统渗透到视网膜外层。

1.2 黏附连接

黏附连接位于紧密连接正下方，可稳定细胞结构和功能并执行多种功能，包括维持细胞间黏附、调节肌动蛋白细胞骨架、参与细胞内信号传导和细胞间通讯等，同时也受到多种细胞机制的调节。黏附连接有3个分子结构域，即微丝、细胞内噬菌斑和膜结构域。其核心蛋白包括经典钙粘蛋白超家族的跨膜糖蛋白，包括E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和P-钙粘蛋白等，及连接蛋白家族成员，包括p120-连环蛋白，β-连环蛋白和α-连环蛋白等。钙粘蛋白的黏附连接对于神经上皮的完整性至关重要，赋予了上皮坚固性和可塑性双重功能特征，使得当组织损伤后可通过快速的细胞间接触重塑加速伤口愈合。此外，黏附连接的坚固性特征在限制细胞迁移中起着至关重要的作用。

黏附连接的核心成分钙粘蛋白分子簇是通过反式的亲和相互作用介导细胞间的黏附。经典的钙粘蛋白在许多上皮细胞中为E-钙粘蛋白，由跨膜受体介导，以蛋白复合物形式发挥作用。E-钙粘蛋白的非结构化胞质区域可直接与β-连环蛋白结合，β-连环蛋白依次与α-连环蛋白结合，形成钙粘蛋白-连环蛋白复合物。复合物中结合的α-连环蛋白还可通过其肌动蛋白结合域与F-肌动蛋白相互作用。这种钙粘蛋白与肌动蛋白细胞骨架的相互作用，构成了上皮的坚固性和可塑性。黏附连接在生物生长发育中也起到了重要作用。一项针对果蝇眼发育的研究发现，黏附连接对于果蝇视网膜神经上皮发育、视网膜细胞极性、控制光感受器状态等方面具有重要作用。

虽然黏附连接研究领域取得了长足的进步，但是许多重要的问题仍存在争议。最近一个新观点更新了传统的黏附连接由钙粘蛋白、β-连环蛋白和α-连环蛋白与肌动蛋白细胞骨架结合组成稳定复合物模型的认识，认为黏附连接是一种动态结构，当其相关蛋白与相邻细胞的对应物产生短暂连接以及E-钙粘蛋白参与肌动蛋白细胞骨架重塑，通过Rac、Cdc42和Arp2/3活性促进细胞表面片状和丝状突起；这些动态突起进一步促进了E-钙粘蛋白相互作用和聚集；这样黏附连接会不断重复形成并加强。尽管钙粘蛋白与β-连环蛋白和α-连环蛋白形成复合物，但这种钙粘蛋白-连环蛋白复合物与肌动蛋白细胞骨架无关；α-连环蛋白不直接将细胞黏附蛋白锚定到肌动蛋白细胞骨架上，而是作为一种调节蛋白来控制肌动蛋白纤维动力学。

Gaonac'h-Lovejoy等研究显示，Ras家族小G蛋白基因

Rap1

突变上皮细胞的黏附连接会浓缩在细胞一侧，而失去其正常的位置分布。以往研究认为黏附连接和紧密连接互不相关，最新证据表明二者之间高度依赖，且之间存在直接连接和信号连接关系，例如，ZO-1通过与Afadin、α-连环蛋白和肌动蛋白结合后的相互作用促进紧密连接和黏附连接，同时通过信号传导调节黏附连接的成熟和紧密连接的后续组装。

1.3 缝隙连接

超微结构下，相邻上皮细胞间的缝隙连接结构为约2 nm的窄隙，此区域内的细胞间通道允许离子、小分子和低分子量代谢物在相邻细胞之间扩散，以保证上皮细胞的许多生理功能，包括传导电信号和调节细胞间信号功能等。在脊椎动物中缝隙连接由来自相邻细胞的连接小体并置形成的缝隙连接蛋白组成。最新研究发现，缝隙连接通道的门控特性和通透性取决于缝隙连接蛋白同工型及其翻译后修饰。组成视网膜的细胞中都存在缝隙连接，其中也包括RPE细胞。据报道，在黄斑变性、青光眼和糖尿病视网膜病变以及相关动物模型中，缝隙连接均与RPE细胞损伤有关。例如压力或者损伤情况下，缝隙连接通过降低代谢缓解细胞间压力，其相连细胞可以共享代谢产物。但在更高压力下，细胞间缝隙连接反而导致代谢产物耗尽而逐步导致细胞死亡。

1.4 桥粒

桥粒被定义为钙依赖性锚定连接点，其主要由桥粒钙粘蛋白家族(包括desmocollins和desmoglein)，Armadillo蛋白家族(包括plakoglobin和plakophilins)和血小板溶素家族(主要为desmoplakin)3种基因家族组成。桥粒通过与中间丝耦合发挥细胞间黏附作用，其中plakoglobin和plakophilins与desmoplakin直接相连，并介导桥粒钙粘蛋白与中间丝相连。超微结构下相邻的RPE细胞间桥粒呈对称分布，但RPE细胞与Bruch膜间这种特化结构呈半桥粒状态。桥粒是一种多蛋白复合体，且其中间丝锚定在质膜上可介导细胞间的黏附，赋予了RPE细胞之间、RPE与基底膜较强的黏附力和细胞骨架结构，具有较强的抗机械力能力。

2 RPE细胞间连接在眼底病变中的作用

2.1 RPE细胞间连接与增生性玻璃体视网膜病变

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)被定义为孔源性视网膜脱离(rhegmatogenous retinal detachment，RRD)和RRD手术后在玻璃体及视网膜内外表面形成无血管的纤维细胞性增生膜，进而收缩和牵拉视网膜所致的一类病变。目前玻璃体切割术、巩膜扣带术是PVR主要的治疗方式。尽管在PVR发病机制研究和手术技巧上已经有了长足进步，但是严重PVR视网膜不能有效复位仍是其复位术失败的主要原因。正常静止状态下，RPE细胞通过紧密连接和黏附连接结合在一起，并通过半桥粒附着在Bruch膜上。RRD发生后，静止的RPE将暴露于玻璃体和血液衍生的细胞因子和生长因子环境下，导致RPE细胞从Bruch膜上脱落。在整个病变过程中，RPE细胞丢失了黏附连接中的E-钙粘蛋白、紧密连接中的ZO-1蛋白和缝隙连接中的缝隙连接蛋白43(connexin 43，Cx43)等上皮连接标志物，最终细胞间连接分解。Zhou等研究发现，RPE细胞保留了重编程能力，可连续地从极化上皮细胞向间充质细胞转变，提示其功能发生障碍，其机制可能与紧密连接破坏、错误折叠的蛋白积累以及一些关键途径失调有关。连接复合物的破坏使RPE细胞在细胞因子和生长因子的刺激下激活信号通路，如β-连环蛋白/Wnt和Hippo信号传导，启动上皮细胞向间充质转化过程，这是PVR发生的重要机制。除此之外，Bao等研究证明在RPE细胞中E-钙粘蛋白、ZO-1和Cx43共定位且彼此直接结合，它们之间的相互作用对于RPE功能具有重要作用，敲低其中1种蛋白质的表达就会导致其他2种蛋白表达下调。Yao等研究表明骨形态发生蛋白7可通过Smad2/3途径抑制转化生长因子-β介导的RPE细胞上皮-间质转化，从而抑制纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的上调以及E-钙粘蛋白和ZO-1的下调，并抑制RPE收缩。Hazim等和Lidgerwood等专注研究紧密连接形成机制，先后证明维生素B家族成员烟酰胺是RPE细胞转分化中紧密连接形成的必要因素；RPE细胞中溶血磷脂酸以受体依赖性机制调节紧密连接。该发现有助于寻找新的PVR治疗干预措施。

2.2 RPE细胞间连接与年龄相关性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是一种进行性慢性疾病，因黄斑感光细胞损伤导致患者发生不可逆视力丧失。RPE长期耗氧产生的氧化应激损伤及生理过程中代谢产物不断累积是AMD发生的主要因素，且氧化应激下RPE细胞自噬功能异常也加速这一病理过程。氧化应激反应直接结果是RPE细胞间连接蛋白不能正常成熟或失去表达，破坏RPE完整性从而导致oBRB破坏。

Borras等通过体外研究发现，补体因子H(complement factor，CFH)基因中的Y402H多态性与AMD发生密切关联；重组CFH可抵抗氧化脂质4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)诱导的ARPE-19和多能干细胞诱导RPE细胞氧化损伤，其原因在于CFH能加强RPE细胞的紧密连接结构，稳定oBRB。自噬是维持RPE上皮形态和功能的关键调控途径。自噬在AMD发病机制中的作用研究广泛，但仍有许多未解答的问题，其中包括RPE细胞自噬异常后对RPE细胞间连接蛋白的影响。Ji Cho等研究发现，当体外HO诱导人RPE细胞系ARPE-19细胞氧化损伤后，硫氧还原蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)表达迅速下调，同时细胞的多项生物活力发生变化，包括自噬活性增加，其机制可能与氧化应激导致AMPK激活有关，而AMPK是自噬过程中细胞能量感知和细胞信号调控的重要激酶；RPE细胞自噬异常可直接破坏紧密连接，破坏RPE的完整性。进一步研究发现，在TXNIP蛋白缺失的ARPE-19细胞中，ZO-1蛋白基本消失，而肌动蛋白应力纤维显著增加，因此研究者认为应力纤维很可能是利用其张力直接破坏RPE细胞间的紧密连接；此外，该研究还显示

TXNIP

基因敲除后可上调缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)的表达，导致RPE细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)增加，这是AMD的另一种病理学基础。

最新研究证实，淀粉样蛋白β可以在体内外激活RPE细胞的核因子(nuclear factor，NF)-κB信号通路，即通过NF-κB信号传导途径破坏RPE细胞的紧密连接。抑制NF-κB信号传导可防止淀粉样蛋白β介导的紧密连接破坏，有助于探索AMD治疗的新靶点。Warden等的研究证明，胆汁酸牛磺胆酸可以通过保护RPE细胞间的紧密连接抑制细胞在百草枯诱导下的氧化损伤。氨基酸同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高引发的高同型半胱氨酸血症通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)破坏BRB，从而诱发AMD，而抑制或消除NMDAR能够通过恢复紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，抑制Hcy诱导的BRB分解，对治疗AMD有一定的临床意义。

2.3 RPE细胞间连接与糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是发达国家工作年龄人群致盲的重要原因。DR的主要病理性特征是视网膜内、外屏障破坏，新生血管生成和视网膜神经变性。在糖尿病进展过程中由于RPE细胞之间的紧密连接蛋白表达降低、紧密连接复合物分解致使脉络膜毛细血管的生物大分子可通过RPE细胞间隙渗漏，形成黄斑水肿。Lopes等研究证明，δ阿片受体激动剂治疗可以通过上调claudin-1、ZO-1等紧密连接蛋白，抑制DR模型中视网膜病变早期VEGF、色素上皮衍生因子的表达，证明其具有治疗DR的潜能。

Zhang等研究表明，链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠RPE细胞HIF-1α和JNK信号通路被激活，细胞中ZO-1和Occludin表达下降，从而导致PRE完整性破坏和oBRB功能受损；而促红细胞生成素可通过下调HIF-1α和JNK信号表达，稳定紧密连接蛋白的表达及oBRB的完整性。体外高糖处理的ARPE-19细胞会发生RPE细胞间紧密连接丢失和形态学损伤，而维生素D可修复这一变化，这一发现在链脲佐菌素诱导的糖尿病模型小鼠眼得到证实。另有研究表明，Norrin蛋白丢失将导致DR表型，VEGF诱导的DR中oBRB损害可以通过注射Norrin蛋白抑制，其机制是Norrin蛋白以黏附连接中β-连环蛋白依赖的方式恢复紧密连接中Claudin-5的表达并恢复oBRB的功能及完整性。在转基因糖尿病小鼠眼中，葡萄糖/淀粉样蛋白β触发的活性氧和晚期糖基化终产物生成可使RPE中ZO-1、Occludin-1、基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达水平下降，桉树素可以通过对抗这些产物，维持RPE细胞间连接和细胞的完整性。这些保护因子可以通过稳定细胞连接表达、维持RPE完整性来抑制DR的发生和发展。

3 总结与展望

在生理以及病理状态下，RPE细胞间连接对于视网膜结构和功能的建立和维持至关重要。RPE细胞作为神经视网膜层和脉络膜层交界处的重要支持细胞，稳定细胞间连接的完整性是维持RPE稳定的首要基础。在病理条件下，RPE细胞间连接，尤其是紧密连接和黏附连接破坏常常是导致各种眼底病变的触发因素。近年越来越多研究开始聚焦RPE细胞间的连接蛋白变化，甚至以这些蛋白的变化作为疾病诊断和治疗效果指标。

有关RPE细胞间连接和眼底病变之间关系的基础研究和临床应用尚不完善。例如，细胞间连接蛋白破坏的具体分子机制还不清楚；关于RPE细胞间缝隙连接破坏与疾病发生关系的研究较少；通过何种给药方式以靶向保护受损部位等问题都值得继续研究和探讨。总之，随着RPE细胞间连接蛋白维持RPE完整性研究的不断深入，有望为眼底疾病诊断和治疗带来新的策略和手段。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突