注射用红花黄色素抗心肌缺血和抗凝量效关系研究

梁五林，蔡梦如，崔爽，张明倩，伍永鸿，欧文静，贾占红，张硕峰（北京中医药大学中药学院，北京 102488）

目前，心血管疾病（CVDs）仍然是人类健康的主要威胁。在CVDs 导致的死亡事件中，约有50%由心肌缺血引起。临床上以及时的心肌血流灌注和心功能保护为心肌缺血的主要治疗原则，但缺血心肌恢复血流再灌注之后会出现心肌损伤进一步加重的现象，被称为心肌缺血再灌注（I/R）损伤，是造成CVDs 病死率升高的主要原因。CVDs 的另一大危险因素是血栓形成，血栓形成是冠心病的重要病变过程，血栓形成后会进一步加重组织缺血损伤，抗凝是抑制血栓形成的临床常用方法。

注射用红花黄色素（SYI）为红花的改良制剂，临床上广泛用于治疗冠心病心绞痛，疗效显著。但SYI 改善心肌缺血损伤及抗凝作用量效关系暂不明确。因此本文旨在研究SYI 抗心肌缺血及抗凝作用量效关系，为SYI 的临床合理用药提供理论参考和实践指导。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠，雄性，体质量190 ～210 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK（京）2019-0010；普通级日本大耳白兔，体质量2.5 ～3 kg，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，许可证号：SCXK（京）2020-0002。

1.2 试药

SYI（规格：50 mg/瓶，浙江永宁药业股份有限公司，批号：1810216）；乌拉坦（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10821102，用生理盐水配制成25%溶液使用）；3.8%枸橼酸钠（北京雷根生物技术有限公司，批号：0507A21）；二磷酸腺苷（ADP，北京世帝科学仪器公司）；花生四烯酸（AA，上海吉至生化科技有限公司，批号：Z404335EA）；凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）测定试剂盒（上海长岛生物技术有限公司，批号分别为201200800、2010004501、201003201）。

1.3 仪器

BL-420I 信息化集成化信号采集与处理系统（成都泰盟科技有限公司）；离体心脏灌流装置（美国Radnoti 公司）；Milli-Q 型超纯水系统（北京五洲东方科技发展有限公司）；MP36 型四道生理信号记录仪、SS19L 型压力换能器（美国BIOPAC公司）；智能恒温水油槽（苏州帕瓦西尔实验设备有限公司）；5810R 高速常温/冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；LG-PABER-1 型血小板聚集凝血因子分析仪（北京世帝科学仪器公司）。

2 方法

2.1 K-H 液配制

以配制1 L K-H 液为例， 称取NaCl 118 mmol，NaHCO24 mmol，KCl 4.7 mmol，KHPO1.2 mmol，MgSO1.2 mmol，EDTA 二钠 0.5 mmol加入到900 mL 超纯水中，每加入一种试剂均充分摇匀溶解，再单独称取CaCl2.5 mmol 加入到100 mL 超纯水中充分溶解，分多次加入至之前所配的900 mL 溶液中，摇匀，最后加入葡萄糖11 mmol，混合均匀，即可得到澄清的K-H 液1 L。

2.2 动物模型建立及分组给药

2.2.1 大鼠在体心肌I/R 损伤模型 将大鼠随机分为假手术组，模型组，SYI 2.5、5、10、20、40 mg·kg组，每组10 ～11 只。给药组于冠状动脉左前降支穿线后即刻尾静脉注射相应浓度药物一次，假手术组和模型组同法给予生理盐水。大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mg·kg）麻醉，仰卧位固定，气管插管，连接呼吸机进行人工辅助呼吸，并连接心电图，剪开胸部皮肤、肌肉，在第四肋间，打开胸腔，暴露心脏，用6-0 手术线，在主动脉圆锥与左心耳交界处下1 mm 处（冠状动脉左前降支）穿线结扎，假手术组仅穿线不结扎。以心电图QRS 波幅加大、ST 段抬高或降低，T 波高耸或倒置作为缺血是否成功的判断标准。结扎45 min 后，剪开结扎线，实现再灌注，再灌注120 min 后，采集血液及心肌组织样本进行检测。

2.2.2 Langendorff 离体大鼠心脏灌流模型将K-H 液倒入至Langendorff 离体灌流装置中，打开智能恒温水油槽，使K-H 液温度稳定在（37±0.5）℃，往K-H 液中持续充入混合气体（95%O，5%CO），使K-H 液呈氧饱和状态。将大鼠随机分为对照组，SYI 0.125、0.25、0.5、1、2 mg·L组，每组8 ～10 只。大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mg·kg）麻醉。打开胸腔，暴露心脏，左手拇指、食指和中指轻轻提起心脏，暴露心底血管，迅速将其剪断，取出心脏立即放入4℃ K-H 液中。漂净血液，剪去肺组织、食道等多余组织，留出长度约1 cm 左右的主动脉。将分离干净的心脏迅速转移，进行主动脉插管，连接Langendorff 离体心脏灌流系统。在左心耳下剪一小口，将自制乳胶球囊经左心耳置入左心室内，固定球囊。球囊与压力换能器相连，可通过多道生理信号采集处理系统监视并记录左心室内压力的变化。对照组用K-H 液平稳灌流60 min，给药组先使用K-H 液灌流，在灌流30 min 后切换含SYI 的K-H 液灌流30 min。

2.3 心肌梗死面积测定

再灌注结束后，取下在体心肌I/R 模型大鼠心脏，用生理盐水清洗干净，置－20 ℃冰箱冷冻10 min，将心脏左心耳以下部分均匀切成5 片，每片厚度约为1 mm，放入1% TTC 溶液中，于37 ℃下染色30 min，正常心肌呈深红色，缺血心肌呈苍白色，再将染好的心脏薄片放入4%多聚甲醛中固定，24 h 后扫描拍照，使用Image J 软件测量每片心肌面积及梗死区面积，计算心肌梗死区面积占心肌总面积的百分比。

2.4 生化指标检测

再灌注结束后，取在体心肌I/R 模型大鼠腹主动脉血，3000 r·min离心15 min，取上清液，按肌酸激酶（CK）和肿瘤坏死因子-

α

（TNF-

α

）测定试剂盒说明书进行操作，检测血清中CK、TNF-

α

的含量。

2.5 离体心脏心功能测定

所有心功能指标由MP36 型四道生理信号记录仪测定采集，使用AcqKnowledge 4.4 软件分析心功能指标左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张压（LVEDP）并计算左心室发展压（LVDP）（LVDP ＝LVSP－LVEDP）、左心室压力最大升高速率（＋dp/dt）和左心室压力最大下降速率（－dp/dt），同时实时记录冠脉流量（CF），在整个实验过程中以记录心脏插管灌流后第30 min时的稳定的数据作为最初的指标值，而后分别记录给药后固定时间点（给药10、20、30 min）的相关指标值。计算给药后各时间点数值相对于灌流30 min 时的数值的变化百分率。

2.6 SYI 体外抗ADP、AA 诱导的家兔血小板聚集作用

取健康兔，禁食12 h，按4 mg·kg耳缘静脉注射25%乌拉坦，分离颈主动脉取血，收集于预先加入了3.8%枸橼酸钠抗凝剂的离心管中（抗凝剂与全血的比例为1∶9），800 r·min离心10 min，取上层液即得富血小板血浆（PRP），剩下部分以3000 r·min离心10 min 取上层液即得贫血小板血浆（PPP），PRP 呈乳白色，PPP呈清亮透明的淡黄色。使用基于比浊法的血小板聚集仪测量血小板聚集率，整个测定控制在4 h内完成，且PRP 不可低温保存和过度振荡。测定时以300 μL PPP 调零，以300 μL PRP 作空白对照。测试杯通道加入搅拌珠，将50 μL 不同质量浓度SYI（10、20、30、40、50 mg·mL）与300 μL PRP 在37 ℃的测试杯内孵育3 min，分别加入诱导剂 ADP（5 μmol·L）、AA（5 mg·mL）各10 μL 诱导血小板聚集，测试并记录10 min 内最大聚集率，计算抑制率。

血小板聚集抑制率（%）＝（对照组血小板聚集率－给药组血小板聚集率）/对照组血小板聚集率×100%。

2.7 SYI 对APTT、TT、PT 的影响

取“2.6”项下中所得PPP，按APTT、TT、PT 试剂盒说明书操作，测定并记录不同质量浓度SYI（5、10、20、30、40 mg·mL）对APTT、TT、PT 的作用。

2.8 统计方法

使用SPSS 24 软件对数据进行单因素方差分析，以

P

＜0.05 表示差异具有统计学意义，数据以

x

±

s

形式表示。

3 结果

3.1 SYI 对心肌I/R 大鼠心肌梗死面积的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死面积显著增加（

P

＜0.01）；而SYI 各剂量组心肌梗死面积均小于模型组（

P

＜0.01），说明各给药组均能一定程度保护心脏组织。SYI 各剂量组之间的心肌梗死面积没有显著差异，但随着给药剂量增加，心肌梗死面积呈下降趋势。结果见表1。

表1 SYI 对心肌I/R 大鼠心肌梗死面积的影响
Tab 1 Effect of SYI on myocardial infarct size in myocardial I/R rats

注：与假手术组组比较， ＜0.01；与模型组比较， ＜0.01。
Note：Compared with the sham group， ＜0.01；compared with the model group， ＜0.01.

组别剂量/（mg·kg－1） 样本数心肌梗死面积/%假手术组－10 0.00±0.00模型组－1125.31±7.15△△SYI 组40 11 7.30±3.78**20 11 9.60±6.64**101110.50±4.66**5 1012.72±7.29**2.5 1013.89±6.69**

3.2 SYI 对心肌I/R 大鼠血清CK、TNF-α 含量的影响

与假手术组比较，模型组血清CK、TNF-

α

含量明显升高（

P

＜0.01）。与模型组比较，SYI 5、10、20、40 mg·kg组血清中CK、TNF-

α

含量明显降低（

P

＜0.05）。SYI 各剂量组之间CK、TNF-

α

含量没有显著差异，但随着给药剂量增加，CK、TNF-

α

呈下降趋势。结果见表2。

表2 SYI 对心肌I/R 大鼠血清CK、TNF- 含量的影响
Tab 2 Effect of SYI on serum CK and TNF- content in myocardial I/R rats

注：与假手术组比较， ＜0.01；与模型组比较， ＜0.05。
Note：Compared with the sham group， ＜0.01；compared with the model group， ＜0.05.

TNF-α/（ng·L－1）假手术组－100.77±0.25103.3±35.2模型组－111.56±0.69△△199.6±61.4△△SYI 组40111.04±0.33*136.7±43.9*20111.06±0.21*151.3±24.1*10111.09±0.60*142.7±64.0*组别剂量/（mg·kg－1）样本数CK/（U·mL－1）5101.12±0.37*155.7±42.6*2.5101.20±0.48155.1±51.1

3.3 SYI 对离体大鼠心脏心功能的作用

3.3.1 SYI 对离体大鼠心脏CF 变化率的影响对照组大鼠心脏CF 相对稳定，而SYI 0.25 ～1 mg·L组在不同的时间段可增加CF，其中0.25 mg·L组效果更好， 而0.125 mg·L和2 mg·L组CF 增加幅度较小。结果见表3。

表3 SYI 对离体大鼠心脏CF 变化率的影响
Tab 3 Effect of SYI on change rate of CF in isolated rat heart

注：与对照组比较， ＜0.05， ＜0.01。
Note：Compared with the control group， ＜0.05， ＜0.01.

组别剂量/（mg·L－1）样本数CF 变化率/%～10 min～20 min～30 min对照组－10 1.29±6.78 1.40±7.38－0.10±6.91 SYI 组0.125 8 2.28±6.09 4.36±4.62 8.22±4.69 0.251010.35±10.00*12.04±8.88** 14.00±8.75**0.510 4.55±6.73 9.69±7.77* 14.07±8.03**1 10 6.72±8.09 9.05±10.61 10.97±15.38*2 10 3.02±6.14 3.36±8.42 3.71±8.69

3.3.2 SYI 对离体大鼠心脏LVDP 变化率的影响

对照组离体大鼠心脏LVDP 随灌流时间的延长缓慢下降，灌流至60 min（SYI 灌流30 min）时LVDP 降低约8.28%。SYI 0.125 mg·L组对离体大鼠心脏LVDP 影响与对照组相似；而SYI 0.25 ～1 mg·L在给药后不同时间点均可减缓离体大鼠心脏LVDP 的减低，其中1 mg·L组效果较好，可使LVDP 增加7.63%～9.36%；SYI 2 mg·L组对LVDP 有抑制作用。结果见表4。

表4 SYI 对离体大鼠心脏LVDP 变化率的影响
Tab 4 Effect of SYI on change rate of LVDP in isolated rat heart

注：与对照组比较， ＜0.05， ＜0.001。
Note：Compared with the control group， ＜0.05， ＜0.001.

组别剂量/（mg·L－1）样本数LVDP 变化率/%10 min20 min30 min对照组－10－3.64±3.11 －6.13±3.44 －8.28±4.66 SYI 组0.125 8－5.28±4.00 －8.18±3.39 －8.42±5.17 0.25 10－2.07±5.85 －3.89±5.15 －4.28±6.32 0.5 10－0.06±4.44 －1.07±6.73 －3.27±7.20 1 10 7.63±9.15*** 8.62±8.54*** 9.36±9.87***2 10－9.99±5.81*－11.61±7.45－12.76±6.72

3.3.3 SYI 对离体大鼠心脏＋dp/dt变化率的影响 对照组离体大鼠心脏＋dp/dt随灌流时间的延长缓慢下降，灌流至60 min 时（SYI 灌流30 min）＋dp/dt降低约2.73%。而SYI 0.125 ～1 mg·L组可随给药时间延长不同程度地增加离体大鼠心脏＋dp/dt值，其中1 mg·L组效果最好，可使＋dp/dt增加9%～14.1%；SYI 2 mg·L组则随给药时间延长不同程度降低离体大鼠心脏＋dp/dt值。结果见表5。

3.3.4 SYI 对离体大鼠心脏－dp/dt变化率的影响 对照组离体大鼠心脏－dp/dt随灌流时间的延长缓慢下降，灌流至60 min（SYI 灌流30 min）时降低约7.74%。而SYI 0.125 ～1 mg·L组可随给药时间延长不同程度地增加离体大鼠心脏－dp/dt值，其中1 mg·L组效果最好，可使－dp/dt增加12.13%～14.95%；而2 mg·L组则随给药时间延长可不同程度地促进离体大鼠心脏－dp/dt值的降低。结果见表5。

表5 SYI 对离体大鼠心脏＋dp/dt 及－dp/dt 变化率的影响
Tab 5 Effect of SYI on change rate of ＋dp/dt and －dp/dt in isolated rat heart

注：与对照组比较， ＜0.05， ＜0.01， ＜0.001。
Note：Compared with the control group， ＜0.05， ＜0.01， ＜0.001.

组别剂量/（mg·L－1）样本数＋dp/dtmax 变化率/%－dp/dtmax 变化率/%10 min20 min30 min10 min20 min30 min对照组－10－0.31±1.45 －1.27±3.06 －2.73±5.80 0.23±3.63 －3.41±2.98 －7.74±4.08 SYI 组0.125 8 0.88±3.31 1.46±3.32 3.40±4.04 0.11±4.51 －0.90±4.91 －1.77±5.32 0.25 10 3.64±7.75 2.94±6.25 3.51±5.58* 3.04±10.14 －0.05±7.57 －1.91±8.06 0.5 10 5.04±4.99 6.54±7.33** 7.02±7.61** 6.86±8.53 6.40±11.71* 3.80±11.93**1 10 9.00±7.23** 12.03±7.15*** 14.10±7.39*** 12.13±11.43** 14.35±11.44*** 14.95±13.77***2 10－5.11±5.48 －6.51±5.43* －6.21±4.87 －8.84±7.96*－11.19±5.96*－13.33±5.80

3.4 SYI 体外抗ADP、AA 诱导的家兔血小板聚集作用

与对照组比较，SYI 在20 ～50 mg·mL范围内均可显著抑制ADP、AA 诱导的血小板聚集（

P

＜0.001），且随着质量浓度的增加，SYI对血小板聚集的抑制率也增加，呈现出量效关系。结果见表6。

表6 SYI 对ADP 和AA 诱导的血小板聚集作用
Tab 6 Effect of SYI on ADP and AA induced platelet aggregation

注：与对照组相比， ＜0.001。
Note：Compared with the control group， ＜0.001.

组别AA 诱导的血小板聚集10 min 内最大聚集率/%ADP 诱导的血小板聚集抑制率/%对照组38.7±3.2－49.7±1.4－SYI 10 mg·mL－1 组 35.9±2.7 7.147.6±2.4 4.1 SYI 20 mg·mL－1 组 32.7±1.3***15.544.6±2.7*** 10.3 SYI 30 mg·mL－1 组 30.1±1.5***22.338.7±1.6*** 22.1 SYI 40 mg·mL－1 组 27.7±1.3***28.433.7±1.5*** 32.3 SYI 50 mg·mL－1 组 24.8±2.0***35.926.1±2.9*** 47.5抑制率/%10 min 内最大聚集率/%

3.5 SYI 对APTT、TT、PT 的作用

与对照组比较，SYI 在5 ～40 mg·mL的范围内均可显著延长APTT（

P

＜0.001）；在10～40 mg·mL范围内可显著延长TT（

P

＜0.05，

P

＜0.001）；在20 ～40 mg·mL范围内可显著延长PT（

P

＜0.001），且随着质量浓度的增加，APTT、TT、PT 也相应增加，呈现出量效关系。结果见表7。

表7 SYI 对APTT、TT、PT 的作用
Tab 7 Effect of SYI on APTT，TT，and PT

注：与对照组相比， ＜0.05， ＜0.001。
Note：Compared with the control group， ＜0.05， ＜0.001.

组别APTT/sTT/sPT/s对照组 33.2±0.915.1±0.815.7±0.6 SYI 5 mg·mL－1 组 37.9±1.0*** 16.4±1.215.9±0.2 SYI 10 mg·mL－1 组 45.4±0.5*** 18.9±1.0*16.0±0.4 SYI 20 mg·mL－1 组 67.8±2.2*** 25.6±1.3***17.6±0.3***SYI 30 mg·mL－1 组 110.4±5.6*** 34.5±3.1***19.7±0.4***SYI 40 mg·mL－1 组 231.9±8.5*** 55.3±4.3***22.5±0.5***

4 讨论

心肌I/R 损伤是导致心脏手术或心肌梗死后发病率和病死率升高的主要原因。心肌I/R 损伤涉及的病理因素包括氧化损伤、能量代谢障碍、Ca超载、线粒体损伤、炎症反应及细胞凋亡等。寻找可以预防或改善心肌I/R 损伤的疗法和药物对CVDs 的临床预后具有重要意义。

目前SYI 对心肌I/R 损伤的作用尚不清楚。因此本研究使用大鼠体内心肌I/R 模型来评估SYI 的作用。CK 主要存在于心肌中，在心肌损伤早期会大量渗漏到血液中，是临床上诊断心肌梗死的主要指标，具有较高的灵敏度和特异性。本次研究结果可见心肌I/R 模型大鼠血清中CK 明显增高，提示I/R 对心肌细胞已造成不可逆损伤，与心肌梗死面积的结果相吻合。SYI可剂量依赖性地减少I/R 诱导的大鼠心肌梗死，显示出对I/R 大鼠心肌的保护作用。在再灌注阶段，随着缺血区域血流的恢复，大量的氧自由基会对血管内皮细胞及心肌细胞造成氧化应激损伤，使TNF-

α

等炎症因子大量产生且释放到心肌组织中，引起炎症反应，进一步加重心肌组织损伤。SYI 各剂量可不同程度地减少 I/R 模型大鼠血清中TNF-

α

含量升高，提示SYI 可能通过减少炎性因子水平，抑制炎症反应来减轻心肌I/R损伤。

离体心脏灌流模型可使研究者在排除神经、体液的干扰下研究心脏的收缩功能和冠状动脉特性，从而观察药物对心脏的直接作用。为进一步观察SYI 对缺血状态下心脏的直接作用，本研究采用Langendorff 离体心脏灌流技术，观察SYI 对离体心脏心功能的作用及量效关系。LVDP和＋dp/dt可反映心肌收缩功能，两者增加则表明心肌收缩能力增强；－dp/dt反映心肌舒张功能，其绝对值增大表明心肌舒张功能和顺应性更好。CF 可用来反映血管扩张和收缩程度。研究结果表明，SYI 可以改善CF、LVDP、±dp/dt等多个心功能指标，且各个指标的改善程度与其对药物的敏感性和耐受性有关，低剂量SYI 对CF 效果更好，而高剂量SYI 对左心室收缩功能更好，并且具有剂量依赖性；但SYI 为2 mg·L时对心脏功能显示抑制作用，除CF 外，各个指标均呈现出下降趋势，提升SYI 改善心肌收缩的治疗窗口较窄。SYI 对CF 的作用提示SYI能够扩张冠状动脉从而增加心输出量，改善组织血流灌注。心肌梗死后左心室异常相关的收缩和舒张功能障碍是影响患者死亡率的决定性因素，维持左心室收缩舒张功能对给缺血心肌提供足够的血液和改善心脏损伤至关重要。SYI 可增加大鼠离体心脏左心室的收缩能力和CF，因此推测SYI 改善在体心肌I/R 损伤的作用机制除了抑制炎症反应减少细胞凋亡外，还可能与改善心脏收缩和舒张功能，扩张血管从而增加心肌供血有关，但具体的作用机制还需在体内心肌I/R 模型中进行验证。

血栓形成可以造成血管闭塞、组织缺血，从而引起许多病变。大多数CVDs 都与血栓形成有关，若供应心脏血流的动脉血栓形成，会导致缺血性心脏病发生。血小板聚集是血栓形成的关键因素，血管受损及一些活化诱导剂（如血小板活化因子、ADP、AA 等）均能引起血小板的活化从而诱导血小板聚集。因此本研究采用ADP、AA 体外诱导家兔血小板聚集来观察SYI是否具有抗血小板聚集作用。研究结果表明，不同质量浓度SYI 可抑制ADP、AA 诱导的家兔血小板聚集，表明SYI 可阻断ADP 和AA 途径抑制血小板活化，对血栓形成具有抑制作用。预防血栓形成的另一个关键过程是抑制血液凝固。血液凝固主要分为三个阶段，分别是凝血酶原激活物形成、凝血酶形成和纤维蛋白形成。其中第一阶段凝血酶原激活物形成可分为内源性和外源性两条途径。APTT 和PT 分别是内源凝血系统和外源凝血系统较为敏感的筛选指标。本次研究发现不同质量浓度SYI 可显著延长APTT 和PT，表明SYI 对内源性和外源性凝血系统均有抑制作用。TT 为血浆凝血酶时间，主要反映纤维蛋白酶原转变为纤维蛋白的时间，纤维蛋白原含量是TT 的主要影响因子。SYI 可显著延长TT，推测SYI 可通过降低纤维蛋白原含量来起到抗凝血作用。以上研究结果提示SYI 可能通过抑制血小板聚集和抗凝血抑制血栓的形成。

SYI 在抗心肌缺血损伤、改善心功能和抗凝血等心血管相关作用方面表现出药理活性，量效关系好，这可为SYI 临床治疗冠心病、心力衰竭、血管闭塞等CVDs 提供理论依据和用药参考。但SYI 抗心肌缺血损伤、抗凝血等具体的作用机制还有待进一步研究。