小分子亮氨酸重复蛋白聚糖家族在维持角膜透明性中的作用

韩涵 综述 何宇茜 张妍 审校

吉林大学第二医院眼科中心角膜屈光科，长春 130041

角膜是一种无血管的透明曲面结构，提供了眼屈光系统约70%的屈光力。角膜包含5层结构，由前向后依次为上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层。其中，角膜基质层是角膜的主要结构，是角膜透明性的主要提供者，含有以Ⅰ型胶原蛋白为主要结构成分的胶原纤维、以小分子亮氨酸重复蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycans，SLRPs)为代表的蛋白聚糖和角膜基质细胞等。SLRPs家族主要分为Ⅰ型(biglycan和decorin)、Ⅱ型(fibromodulin、keratocan和lumican)和Ⅲ型(osteoglycin)。生理状态下，SLRPs家族成员间相互作用并与胶原蛋白相互作用，共同维持合适的胶原纤维直径和纤维间距，在调控胶原纤维的形成、装配和空间上的有序排列中起重要作用。此外，SLRPs还可以通过结合转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等细胞因子及其受体在角膜创伤修复和基质重塑等病理过程中发挥重要作用。深入理解SLRPs在角膜透明性维持生理病理过程中的作用对于我们探索角膜透明性下降等疾病的治疗手段具有重要意义。本文就生理病理状态下SLRPs维持角膜透明的分子机制和SLRPs家族成员间的相互作用进行综述。

1.SLRPs家族成员及其生物学活性

SLRPs均由含有亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats，LRRs)的同源核心蛋白和1～2个通过共价键与核心蛋白连接的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)侧链构成。角膜基质层中的SLRPs主要由角膜基质细胞分泌，并依据GAG侧链的类型主要分为3类，即含有硫酸皮肤素(dermatan sulfate，DS)的Ⅰ型SLRPs、含有硫酸角质素(keratan sulfate，KS)的Ⅱ型和Ⅲ型SLRPs。SLRPs可通过GAG侧链影响细胞生长、结合水分子和生长因子，调控基质含水量以及胶原纤维的形成、装配和排列，进而维持角膜透明性；同时，核心蛋白中央区的LRRs也可帮助SLRPs与胶原蛋白、生长因子及其细胞膜受体等蛋白质发生相互作用，从而促进SLRPs对角膜透明性的调节作用。

1.1 Ⅰ型SLRPs

1.1.1

结构及分布 Decorin和biglycan均属于Ⅰ型SLRPs，结构包含10个LRRs和N端特异性丝氨酸序列(CXCXCXC)。在角膜发育阶段，decorin和biglycan在角膜基质层中均匀分布且含量均较高；在成熟角膜基质层中，biglycan含量有所降低；而在角膜创伤修复过程中，角膜基质层中biglycan含量有所升高。

1.1.2

生物学活性 Decorin和biglycan在维持角膜基质层胶原纤维的正常结构和排列等方面发挥重要作用。Decorin缺失小鼠模型中角膜胶原纤维直径增大、排列紊乱，角膜透明性明显下降。此外，decorin可通过降低血小板内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule,Pecam)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等促血管生成因子的表达，抑制角膜新生血管，提高角膜透明度。Biglycan与decorin存在补偿性作用。在decorin缺失模型小鼠发育阶段，角膜基质层中biglycan的表达将会上升，可部分缓解因decorin缺失而产生的不良效应；而在biglycan缺失模型小鼠发育阶段，角膜基质层decorin的表达量并未代偿性升高，故推测decorin是胶原纤维形成的主要调节分子，而biglycan是补偿性调节分子。因此，当decorin缺失时，biglycan表达代偿性升高；而当decorin和biglycan均缺失时，会产生基质层胶原纤维直径增大且形态不规则、基质层后部纤维直径增大和形态较前部更不规则等影响，胶原纤维堆积和基质层的有序结构受到破坏，影响角膜透明性的维持。在decorin缺失模型小鼠的成体阶段，角膜透明性并未显著下降，但会出现皮肤脆性增加、肌腱无力和气道阻力降低等症状；而在biglycan水平较低的成年患者骨骼中，成骨细胞数量和活性均下降，易引起骨质疏松症等骨骼疾病，严重影响患者的生存质量，但这些患者的角膜并未出现异常。

1.2 Ⅱ型SLRPs

1.2.1

结构及分布 Lumican、keratocan和fibromodulin均属于Ⅱ型SLRPs，结构包含10个LRRs和N端特异性丝氨酸序列(CXCXCXC)。胚胎发育阶段及刚出生时，lumican和keratocan在角膜基质层中分布均匀，fibromodulin主要分布在角膜表面和基质层后部；成熟角膜中，lumican的表达被限制在角膜基质层后部，而keratocan仍均匀分布于角膜基质层，fibromodulin在基质层中的表达减少，定位于角膜缘。

1.2.2

生物活性 Lumican在维持角膜透明等方面发挥重要作用。Chakravarti等对lumican缺失模型小鼠的角膜进行研究，发现模型小鼠出生后透明角膜逐渐变混浊。Lumican缺失引起的胶原纤维直径增大、排列紊乱等不良效应主要局限在基质层后部，这与角膜发育成熟过程中lumican由均匀分布在角膜基质层中逐渐变为仅分布在基质层后部相一致。进一步对lumican缺失模型小鼠的角膜进行研究发现，lumican可通过改变自身表达模式使其仅在基质层后部表达，从而把lumican缺失引起的小鼠角膜混浊限制于基质层后部；同时，通过移植人脐带间充质干细胞至lumican缺失模型小鼠角膜基质层后，角膜基质层lumican表达增加，基质层胶原纤维直径变小、形态变规则，胶原纤维有序排列，角膜透明度有所恢复。此外，发育成熟过程中lumican的GAG侧链在酶催化下发生硫酸化，以促进角膜透明性的形成。

在发育和成体阶段，keratocan缺失可引起角膜基质层变薄、基质胶原纤维直径轻度增大，可能与扁平角膜的发生有关，但其未对角膜透明性造成明显影响。此外，在成年小鼠角膜中，keratocan仅在角膜基质细胞中表达，因此keratocan可以作为角膜基质细胞的标志物，用于角膜基质的组织特异性启动子等遗传靶点的操控。Fibromodulin与lumican有50%氨基酸序列相同，可与lumican竞争结合Ⅰ型胶原蛋白的结合位点，促进胶原纤维的成熟。Fibromodulin缺失可能会影响角巩膜整合，但未对角膜透明性造成明显影响。

Lumican与SLRPs其他家族成员间存在多种相互作用。Lumican与decorin以及biglycan间均存在协同作用，共同调节角膜胶原纤维结构和空间排列。Lumican与fibromodulin间也存在补偿作用。在fibromodulin缺失模型小鼠角膜中lumican含量代偿性升高；同时，lumican和fibromodulin均缺失的模型小鼠角膜基质胶原纤维缺陷较仅lumican缺失模型小鼠更严重，推测二者还存在协同作用。人突变

lumican

转基因模型小鼠角膜中biglycan、decorin和keratocan表达均下降，与圆锥角膜患者角膜中SLRPs的表达改变相类似，提示

lumican

基因突变可能与圆锥角膜相关。

1.3 Ⅲ型SLRPs

Osteoglycin属于Ⅲ型SLRPs，主要定位于角膜上皮细胞、上皮基质膜和基质层的角膜基质细胞中，其结构包含6个LRRs和N端特异性丝氨酸序列(CXCXCXC)。在osteoglycin缺失小鼠的角膜发育阶段，角膜结构并不会出现明显改变，角膜透明性也未受到明显影响。Osteoglycin在角膜中的作用较小，但其在血管的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中发挥重要作用。Wang等研究发现大鼠主动脉平滑肌细胞敲除

osteoglycin

基因后，通过VEGF和VEGF受体2(VEGF receptor 2，VEGFR2)促进细胞的增生和迁移。

2.SLRPs家族调控角膜胶原纤维正常排列

2.1 SLRPs调节角膜胶原纤维间的横向排列

SLRPs在调节角膜胶原纤维间的横向排列中发挥重要作用。缺乏SLRPs，尤其是decorin和lumican，将引起胶原纤维直径增大、形态不规则，最终导致角膜透明度降低、混浊等症状。角膜胶原纤维横向排列可分为六边形网格和无定形网格，对于SLRPs如何调节胶原纤维横向排列的分子机制仍存在争议。

2.1.1

SLRPs调控六边形网格形成 Sawada等根据ECM中胶原纤维通过蛋白聚糖链与相邻6条胶原纤维相连等观察结果，提出定长的蛋白聚糖链可以驱动胶原纤维形成稳定六边形网格的机制。具体而言，胶原纤维表面存在的疏水力和静电力可以驱动相邻且平行的胶原纤维聚集形成更粗的纤维，而SLRPs的核心蛋白可以屏蔽这2种力，从而抑制相邻且平行的胶原纤维聚集形成化学键并形成更粗的纤维，防止角膜混浊。

2.1.2

SLRPs调控无定形网格形成 根据吉布斯-唐南效应，SLRPs的GAG侧链带负电荷，可吸引带正电荷的离子，使胶原纤维间的离子浓度增加，从而通过渗透作用吸引水分子进入胶原纤维间，胶原纤维间过多的水分子会形成压力，构成胶原纤维间的排斥力；与此同时，连接2个或多个胶原纤维的GAG侧链受热驱动而不能形成完全伸展的构象，导致侧链的末端紧密附着于胶原纤维上，从而提供胶原纤维间的吸引力；这2种相反的力最终会达到平衡，形成无定形网格，保证胶原纤维间的有序排列。相邻胶原纤维间通过蛋白聚糖的结合是被不断打破和重建的，该特性使角膜在结构上富于流动性，便于营养物质和代谢废物在角膜中的运输，并有利于角膜消除由外压引起的弹性变形。

2.2 SLRPs调节胶原纤维间的纵向排列

胶原蛋白组装形成胶原纤维前先与SLRPs形成复合物，复合物组装形成两端呈锥形的胶原纤维，胶原纤维表面覆盖的SLRPs可抑制相邻纤维间的侧向聚合；由于表面覆盖SLRPs的数量随着胶原纤维直径的减小而减少，导致纤维尖端的SLRPs数量较少，甚至没有，因此胶原纤维易发生端对端融合，促进纤维的纵向生长。此外，随着基质中SLRPs的GAG侧链电荷密度增加，端对端融合的概率也会增加，这对形成有序的胶原纤维间环境起诱导作用，促进纤维的延长。

3.SLRPs家族在角膜创伤修复中的作用机制

角膜创伤修复是一系列动态级联反应过程。首先，受损区的角膜基质细胞迅速凋亡，部分基质细胞坏死。然后，临近受损区的基质细胞增生、迁移，进而转分化为成纤维细胞和肌成纤维细胞。角膜创伤修复是由多种细胞及细胞因子在时间、空间上高度协调完成的，其中SLRPs在这一过程中发挥重要作用。

TGF-β是一种促纤维化细胞因子，生理状态下，仅存在于角膜上皮；角膜损伤后TGF-β被释放到基质层，也可由肌成纤维细胞合成并分泌，加速炎症反应，促进创伤修复，但后期的过度表达可导致ECM合成及降解失衡，引起角膜纤维化。相关研究表明，小鼠角膜损伤后对混浊有着更强的抵抗能力，这是因为角膜基质层中decorin的表达具有种属差异，相较于兔和人，小鼠角膜中decorin表达量更高，可以充分结合并中和TGF-β。通过基因疗法或将decorin包埋入凝胶同样可促进角膜创伤小鼠或兔模型的无瘢痕修复。此外，decorin还可作为基质层成纤维细胞细胞膜上表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的配体，与其形成复合物并通过细胞膜穴样内陷介导的内吞作用降解EGFR，以抑制EGFR信号通路和成纤维细胞的迁移，从而调节角膜的创伤修复。

Lumican也在角膜创伤修复中发挥重要作用。Lumican是目前唯一已知的在角膜创伤修复中由角膜上皮细胞表达的SLRPs。Lumican缺失模型小鼠角膜伤口愈合变慢，而重组lumican在整合素β1、局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)和细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)的介导下，促进角膜上皮细胞迁移，加速伤口愈合。同时，在创伤修复过程中，lumican被多种基质金属蛋白酶切割产生C端活性产物，该活性产物通过结合TGF-β受体1促进角膜上皮细胞的增生和迁移。此外，在角膜基质层中，lumican可通过激活Fas/Fas配体系统增强基质细胞凋亡，以调控角膜创伤修复过程。

4.SLRPs家族在角膜基质重塑中的作用机制

角膜基质创伤修复过程中基质细胞的死亡、促纤维化细胞因子和炎症因子的释放、中性粒细胞等的招募和ECM降解酶的产生等事件共同导致基质重塑。在角膜基质重塑的发生中，SLRPs可通过调节基质细胞转变为成纤维细胞和肌成纤维细胞的过程发挥调控作用。

在角膜基质细胞转分化为成纤维细胞和肌成纤维细胞的过程中，会丧失keratocan和lumican等的分泌功能，且肌成纤维细胞会大量产生含有biglycan、排列紊乱、过度压缩的异常基质，这些异常基质沉积在角膜基质层中，导致基质重塑。由于decorin还可通过与TGF-β形成复合体或竞争性结合TGF-β受体，以降低TGF-β的生物利用率，从而抑制瘢痕形成和减轻角膜混浊，因此基因转染过表达decorin可抑制TGF-β诱导的基质细胞转分化和基质重塑。

5 小结与展望

SLRPs作为角膜的重要组成部分，在维持角膜胶原纤维的正常排列、创伤修复和基质重塑等过程中发挥重要调节作用。SLRPs家族成员间存在补偿作用和协同作用，但是SLRPs家族成员间的相互作用和SLRPs调节胶原纤维横向、纵向排列的分子机制仍有待进一步研究。SLRPs与角膜创伤修复和基质重塑等多种病理过程相关，通过研究以decorin和lumican为代表的SLRPs与表皮细胞生长因子、TGF-β等细胞因子及其受体的相互作用、下游信号通路对于深入认识角膜相关疾病具有重要意义，为相关临床治疗提供理论依据。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突