雷公藤治疗系统性红斑狼疮的网络药理学分析*

杨锋磊，纪 伟

(1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.江苏省中医院风湿科，江苏 南京 210029)

系统性红斑狼疮(SLE)是一种好发于育龄期女性，以多脏器受损为主要临床特征的慢性自身免疫性疾病，主要累及心、肺、肾、脑等多个系统。SLE在中国大陆地区的患病率为30/10万～70/10万[1]，男女比例约为1∶9。目前SLE发病机制不明，存在较多争议，多认为是免疫、遗传、感染、性激素等因素综合作用导致。SLE治疗多采用糖皮质激素联合免疫抑制剂，同时，长期使用此治疗方案带来的一些不良反应，如骨髓抑制、肝肾损伤和骨质疏松等不容忽视。

中药雷公藤具有清热化瘀、利水消肿、祛风除湿、止痛等功效。雷公藤常被运用于治疗风湿免疫疾病，被用于SLE的治疗且疗效确切。既往基础研究及临床研究表明，雷公藤有效成分及其制剂等可以改善狼疮小鼠症状及相关指标，在治疗SLE过程中，与激素或免疫抑制剂联用优于单用激素或免疫抑制剂[2-5]。雷公藤治疗SLE虽有一定的临床疗效，但对其作用机制研究却并不全面，本研究力求通过网络药理学，深入挖掘雷公藤有效成分治疗SLE潜在作用机制，为雷公藤治疗SLE提供理论依据。

1 资料与方法

1.1雷公藤有效成分、靶点基因的筛选 在TCMSP平台[6]以口服生物利用度(OB值)≥30%、药物相似性(DL值)≥0.18为筛选条件，初步筛得雷公藤有效活性成分及相应靶标，将药物靶点在Uniprot数据库[7]中处理成标准化基因名。

1.2SLE疾病靶点信息的筛选 以“systemic lupus erythematosus”为关键词在Genecards[7]、OMIM[7]、TTD[8]、Drugbank[9]数据库中检索，去重后，获取SLE疾病相关靶点。

1.3雷公藤对SLE作用靶点预测 将收集到的雷公藤成分靶点和SLE靶点导入Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)相互映射，得到两者共同靶点，即雷公藤治疗SLE潜在作用靶点。采用Cytoscape软件(V3.9.0)绘制“雷公藤-活性成分-潜在作用靶点-SLE”图。

1.4蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建 雷公藤对SLE的治疗效应是多个蛋白交互作用的结果。使用STRING网络数据库[10]分析雷公藤治疗SLE的作用靶点，形成PPI，筛选置信度0.400以上的蛋白互作关系数据，将其导入Cytoscape软件(V3.9.0)重新绘制可视化作用靶点的PPI网络。

1.5GO和KEGG富集分析 为分析雷公藤治疗SLE的潜在作用机制，了解其靶点在基因功能和信号通路中的作用，将雷公藤治疗SLE靶点导入DAVID数据库[11]，展开GO、KEGG富集分析。限定物种为“Homo sapiens”，标识符设置为“official gene symbol”，设定P<0.05，用微生信作图工具(http://www.bioinformatics.com.cn/login/)将富集结果中与疾病相关基因功能及信号通路进行可视化展示。

2 结 果

2.1雷公藤成分靶点和SLE疾病靶点筛选 在TCMSP数据库共获得雷公藤51种潜在药效成分、493个相关靶点，剔除23个没有对应靶点的成分和343个重复靶点，得到28个药物有效成分和150个对应靶点。根据收集到的数据构建“雷公藤-活性成分-靶点”网络图，见图1。图中结点(node)表示雷公藤、活性成分、潜在靶点，边(edge)表示三者之间的关系。其中多个成分可以共同作用于一个靶点，度值(dgree)>30的成分分别为山柰酚(63)、β-谷甾醇(39)、雷公藤甲素(35)、川陈皮素(35)、豆甾醇(31)。在Genecards、OMIM、TTD、Drugbank数据库中搜索“systemic lupus erythematosus”，去重后得到与SLE相关的靶点共1 447个。

2.2雷公藤-SLE治疗靶点预测 利用VENNY2.1.0将150个雷公藤靶点与1 447个SLE相关靶点取交集，雷公藤-SLE共同靶点共有82个，即雷公藤治疗SLE作用靶点，见图2。将药物、活性成分、关键作用靶点和疾病关系导入Cytoscape软件(V3.9.0)中构建“雷公藤-活性成分-潜在作用靶点-SLE”图，见图3。从图中可以看出，在雷公藤28个活性成分中，与82个潜在作用靶点相连接的共27个，治疗SLE主要依靠5种活性成分：山柰酚(40)、雷公藤甲素(30)、川陈皮素(22)、β-谷甾醇(21)、豆甾醇(12)。

2.3PPI构建及关键靶点筛选 将82个共同靶基因导入STRING在线数据库中，初步构建PPI网络图，去除游离靶点，该图共涉及81个靶基因、1 054条基因互作关系线，见图4。将在STRING数据库中得到的TSV文件导入Cytoscape软件(V3.9.0)中，重新绘制PPI图，见图4。颜色越深、结点越大对应的degree值越大；边越粗、颜色越深反映combined score值越大。将degree值大小进行降序排序，筛选排名前30的靶基因，绘制核心基因图，见图4。TNF、AKT1、JUN、VEGFA、TP53、CXCL8、PTGS2、MMP9前8个基因排名较前，这些degree值较大的基因可能在雷公藤治疗SLE的网络中发挥重要作用。绘制前8位核心基因与雷公藤主要活性成分对应关系，发现除PTGS2外其余7个基因均与主要有效成分相连，此7个基因为核心基因。见图4。

2.4GO功能富集分析 雷公藤治疗SLE的GO功能富集分析见图5，结果显示，雷公藤治疗SLE主要涉及细胞因子介导的信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、炎性反应、对药物的反应等生物学过程；涉及质膜、细胞外区、大分子复合物等细胞组成；涉及相同的蛋白质结合、蛋白质同二聚化活性、酶结合、类固醇结合等分子功能。

2.5KEGG通路富集分析 雷公藤治疗SLE的KEGG通路富集分析结果见图6，结果显示，雷公藤治疗SLE的效应机制主要与皮质类固醇和心脏保护、通过 Nrf2 诱导基因表达的氧化应激、Th1/Th2 分化、非分型流感嗜血杆菌激活NF-κB、Toll样受体通路、人类巨细胞病毒和图激酶途径、T细胞极化过程中趋化因子受体的选择性表达等信号通路有关。

3 讨 论

本研究基于网络药理学分析方法，筛选获得雷公藤有效成分28种，主要通过82个潜在作用靶标治疗SLE，根据雷公藤-成分-疾病-靶点网络图结果显示，山柰酚、雷公藤甲素、川陈皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等为雷公藤治疗SLE的关键成分。山柰酚属于黄酮类化合物，具有抗癌、抗炎、抗氧化应激等生理功能[12]。研究表明，山柰酚通过降低促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-8)的表达和AGS细胞中IL-8的产生，起到抗炎作用[13]。NLRP3炎症小体在SLE疾病发展过程中的作用已被证实[14]，即抗原抗体免疫复合物通过上调Toll样受体依赖的NF-κB途径及刺激活性氧的产生，激活NLRP3炎症小体，使IL-1β等分泌增加，加重SLE患者病情。山柰酚可以促进细胞自噬，灭活NLRP3炎症小体，仍需要更多研究证实山柰酚对SLE的治疗作用。雷公藤甲素在治疗SLE时具有减轻肾损伤、改善皮肤及黏膜损伤、减轻血管炎性反应等作用。SLE患者外周血Tc与Th细胞比例在疾病发展不同阶段存在差异，疾病活动期Tc/Th失衡，Th1/Th2、Tc1/Tc2值增加[15-16]。雷公藤甲素[17]通过抑制Tc1/Tc2、Th1/Th2值，调节细胞因子分泌，使不同阶段Tc、Th比值相对稳定，从而减轻自身免疫组织损伤，控制SLE疾病进展。川陈皮素具有抗氧化、减少MMPs和炎症表达的特性，通过激活SIRT-1/FOXO3a介导的自噬和线粒体功能来改善肝缺血和再灌注损伤[18]。LIN等[19]发现，川陈皮素抑制人滑膜细胞中IL-1诱导的PGE2的产生及干扰脂多糖诱导的PGE2的产生。β-谷甾醇、豆甾醇属于植物甾醇[20]，通过减少促炎性细胞因子及趋化因子的释放，抑制STAT1信号通路，发挥抗炎作用。

根据构建的雷公藤-SLE蛋白互作网络及条形图，TNF、AKT1、JUN、VEGFA、TP53为排列前5的靶蛋白。TNF[21]是一种主要的炎性细胞因子，能够促进机体抗原与T淋巴细胞产生免疫应答，被发现在SLE患者血清中升高，并与SLE疾病活动度呈正相关。AKT1[22]在PI3K/AKT信号通路处于下游位置，在外周B细胞分化和T细胞稳态中发挥作用，参与血管生成、蛋白合成等生物学过程，其通过激活PI3K/AKT/mTOR通路，激活IL-17、IL-4等细胞因子，抑制Treg细胞而参与SLE发病过程。另有研究发现，SLE患者B细胞中AKT上调表达，AKT激活mTOR促进B细胞增生[23]。JUN[24]通过参与SLE患者分泌产生AP-1依赖的促炎性细胞因子及FCGR2B启动子激活的转录调控过程，影响SLE疾病的进程。VEGFA[25]，通常被称为VEGF，是内皮细胞功能障碍、毛细血管通透性增加和血管生成的关键调节因子，连续血管生成、免疫介导的血管内皮细胞损伤和功能障碍在SLE中起着重要的病理作用[26]，有研究表明，雷公藤在对BALB/c裸鼠诱发性红斑狼疮模型的治疗中，可阻断VEGFA与VEGFR1结合，抑制血管炎性反应，减少组织血管新生及皮损[27]。

靶点GO功能富集分析显示，雷公藤治疗SLE主要涉及细胞因子介导的信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、炎性反应、对药物的反应等生物学过程；涉及质膜、细胞外区、大分子复合物等细胞组成；涉及相同的蛋白质结合、蛋白质同二聚化活性、酶结合、类固醇结合等分子功能。

靶点KEGG通路富集分析结果显示，雷公藤治疗SLE的效应机制主要与皮质类固醇和心脏保护、通过 Nrf2 诱导基因表达的氧化应激、Th1/Th2 分化、非分型流感嗜血杆菌激活NF-κB、Toll样受体通路、人类巨细胞病毒和图激酶途径、T细胞极化过程中趋化因子受体的选择性表达等信号通路有关。雷公藤可增强肾上腺皮质功能[28]，其乙酸乙酯提取物兴奋下丘脑-垂体-肾上腺轴，促进皮质激素分泌。有研究证实，雷公藤多苷联合激素治疗SLE在降低患者疾病活动度方面优于常规激素疗法，可能与雷公藤多苷促进GR表达，自身糖皮质激素结合GR增多，自身免疫应答得到抑制有关。能否使用雷公藤促进SLE患者减少激素用量仍需要更多临床研究证实[29-30]。通过 Nrf2 诱导基因表达的氧化应激通路是抗氧化防御的重要信号通路，有研究显示，SLE患者的血液、组织和免疫细胞中的氧化应激水平升高，氧化应激水平与疾病活动度相关，证明Nrf2具有治疗SLE的靶标潜力[31-33]。巨细胞病毒(CMV)属于疱疹病毒家族[34-35]，在有初始症状或疾病恶化的SLE患者中观察到CMV DNA和高血清IgM抗CMV水平，CMV感染被认为可能是SLE发病重要的病因。

本研究基于网络药理学阐述雷公藤活性成分及相关靶点，分析雷公藤治疗SLE的相关靶点及通路，初步预测其主要成分山柰酚、雷公藤甲素和川陈皮素等通过TNF、AKT1、JUN、VEGFA、TP53等核心靶点，以及皮质类固醇和心脏保护、通过 Nrf2 诱导基因表达的氧化应激、Th1/Th2 分化等信号通路治疗SLE。雷公藤治疗SLE作用机制具有多成分、多靶点、多通路的特性，为临床及实验研究雷公藤治疗SLE作用机制、有效撤减激素提供理论依据。