高效液相色谱波长切换法同时测定黄疸茵陈颗粒中8种指标性成分的含量

2022-11-11毛淑倩

中国药业 2022年21期

毛淑倩

（中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院，福建福州 350000）

黄疸茵陈颗粒由茵陈、黄芩、大黄、甘草组方，具有清热利湿、退黄疸功效，临床用于治疗急、慢性黄疸型传染性肝炎[1］。方中，茵陈为君药，具有清热利湿、利胆退黄等功效，可有效治疗黄疸、湿热型湿疹、胆囊炎及肝内胆汁淤积症等，含有机酚酸类、香豆素类、黄酮类、挥发油等成分[2-3］，2020年版《中国药典（一部）》以滨蒿内酯来评价绵茵陈中绿原酸及花茵陈的质量[4］。黄芩为臣药，清肝胆、祛湿，主要有效成分为黄酮类化合物黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷，具有保肝、解毒、解热、抗炎等药理作用[5-7］。大黄为佐药，清湿热、逐瘀通经以退黄疸，其蒽醌类成分大黄酚可抑制脂质过氧化反应及改善肝细胞凋亡，从而发挥保肝利胆作用[8-9］。甘草为使药，性温，调和诸药，主要活性成分为甘草酸铵[10］。黄疸茵陈颗粒收载于《中华人民共和国卫生部颁药品标准·中药成方制剂（第四册）》，其质量标准无含量测定项[1］，现有文献仅以该制剂中茵陈、黄芩及大黄的有效成分进行定量分析[11-13］。本研究中建立了同时测定黄疸茵陈颗粒中绿原酸、滨蒿内酯、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、大黄酚、甘草酸铵8种指标性成分含量的高效液相色谱（HPLC）波长切换法，为有效控制黄疸茵陈颗粒的质量提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配有紫外可变波长检测器；BT25S型电子天平（赛多利斯科学仪器＜北京＞有限公司，精度为0.01 mg）；DTA-25型超声波清洗器（湖北鼎泰高科有限公司，功率为600 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号为110753-202118，纯度为96.1%），滨蒿内酯对照品（批号为111511-202004，纯度为99.9%），黄芩苷对照品（批号为110715-202122，纯度为94.2%），汉黄芩素对照品（批号为111514-202006，纯度为95.9%），黄芩素对照品（批号为111595-201808，纯度为97.9%），汉黄芩苷对照品（批号为112002-201902，纯度为98.5%），大黄酚对照品（批号为10796-201922，纯度为99.4%），甘草酸铵对照品（批号为110731-202119，纯度为97.8%），均购自中国食品药品检定研究院；黄疸茵陈颗粒（福建省泉州罗裳山制药厂，批号分别为201001054，201012061，202102029，甘肃岷海制药有限责任公司，批号分别为20210117，20210305，20210528，兰州佛慈制药股份有限公司，批号分别为190919，191127，201112，规格均为每袋20 g）；甲醇、甲酸均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[14-16］

色谱柱：Supfex JX C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.12%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min时16%A，15～44 min时16%A→58%A，44～60 min时58%A→70%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：0～44 min时325 nm（绿原酸、滨蒿内酯、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷），44～50 min时237 nm（甘草酸铵），50～60 min时258 nm（大黄酚）；柱温：35℃；进样量：10µL。

2.2 溶液制备

分别取绿原酸、滨蒿内酯、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、大黄酚、甘草酸铵对照品各适量，精密称定，加甲醇适量，超声（功率为500 W，频率为40 kHz）使溶解，配制成每1 mL含绿原酸1 208.0µg、黄芩苷975.3µg、滨蒿内酯298.6µg、汉黄芩素361.1µg、黄芩素611.4µg、汉黄芩苷370.7µg、甘草酸铵581.9µg、大黄酚566.5µg的混合对照品溶液。取样品10袋，研匀，取细粉2.0 g，精密称定，置250 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 mL，称定质量，超声（功率为500 W，频率为40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45µm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。按处方工艺分别制备缺茵陈、黄芩、大黄、甘草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：分别吸取2.2项下3种溶液各10µL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果8种指标性成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.52，对称因子均小于1.11。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.Chlorogenic acid 2.Baicalin 3.Scoparone 4.Wogonin 5.Baicalein 6.Wogonoside 7.Ammonium glycyrrhizinate 8.Chrysophanol A.Mixed reference solution B.Test solution C-F.Negative reference solution（lack of Artemisiae Scopariae Herba，Scutellariae Radix，Rhei Radix et Rhizoma and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察与检测限和定量限确定：分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，得系列质量浓度的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表1。分别以信噪比（S/N）为10∶1和3∶1时混合对照品溶液的质量浓度为定量限和检测限，结果见表1。

精密度试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液1.0 mL，置25 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释并定容，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次。结果绿原酸、滨蒿内酯、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、大黄酚、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.25%，0.99%，0.51%，0.63%，0.44%，0.82%，0.59%，0.72%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为190919）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于0，5，10，15，20，25 h时进样测定。结果绿原酸、滨蒿内酯、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、大黄酚、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.87%，1.09%，0.91%，1.02%，0.84%，0.76%，0.91%，0.59%（n=6），表明供试品溶液25 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（批号为190919）6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。采用外标法计算得绿原酸、滨蒿内酯、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、大黄酚、甘草酸铵的平均含量分别为3.861 0，0.319 7，1.545 0，0.507 2，0.869 3，0.501 5，0.718 6，0.759 1 mg/g，RSD分别为0.79%，0.97%，0.86%，1.04%，1.17%，1.05%，1.25%，0.66%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为190919）1.0 g，精密称定，共6份，置具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表1。

表1 8种指标性成分方法学考察结果（n=6）Tab.1 Results of the methodological investigation of eight index components（n=6）

2.4 样品含量测定

取9批样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定3次，采用外标法计算样品中8种指标性成分的含量。结果见表2。

表2 样品中8种指标性成分含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of eight index components in samples（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 检测波长选择

全波段扫描8种活性成分，结果甘草酸铵在237 nm波长处有最大吸收，大黄酚在258 nm波长处有最大吸收，黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷的最大吸收波长相似，滨蒿内酯于345 nm波长处有最大吸收，且出峰时间接近黄芩苷。2020年版《中国药典（一部）》中茵陈含量测定项下绿原酸的检测波长为327 nm。故采用波长切换法，最终确定为2.1项下检测波长，在同一信号的不同时间段设置不同的检测波长，使黄疸茵陈颗粒中8种指标性成分均可被灵敏、准确地检出，并节省了分析时间。

3.2 耐用性考察

分别考察了不同体积分数（0.1%，0.12%，0.15%）的甲酸溶液，不同品牌的色谱柱[Supfex JX C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm），Waters XTERRA MS C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm），Thermo Hypersil Gold C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）］，不同柱温（30，35，40℃），不同流速（0.8，1.0，1.1 mL/min）对黄疸茵陈颗粒中8种指标性成分色谱峰分离的影响。结果各成分均能达到有效分离，表明方法耐用性良好。且按2.1项下色谱条件检测时色谱峰分离效果最佳。

3.3 含量测定结果分析

考察了3家生产企业的9批样品中绿原酸、滨蒿内酯、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、大黄酚、甘草酸铵的含量。由表3可知，不同生产企业的样品中各成分含量存在差异，其中滨蒿内酯的含量差异最明显，仅1家生产企业检出滨蒿内酯，且生产年份为2019年，其他生产企业均未检出。原因可能为该生产企业投料时选择了花茵陈。黄疸茵陈颗粒中茵陈占处方总量的49%，茵陈药材包括绵茵陈和花茵陈，滨蒿内酯主要存在于花茵陈，在绵茵陈中含量极微，这与传统习惯采用绵茵陈投料一致[17］。