C1q坏死因子相关蛋白12、脂联素在脑动脉粥样硬化大鼠血清中的表达及其与磁共振成像技术参数相关性研究

宋 炜，徐晓军，张学平

(1.陕西省康复医院影像科,陕西 西安 710065;2.榆林市星元医院磁共振室,陕西 榆林 719000)

颅内动脉粥样硬化是指脑动脉的管壁由于脂类物质沉积和内膜受损，血小板、纤维素等物质聚集在损伤的内膜上，引起管壁结缔组织增生、内膜粗糙、失去弹性以及管腔狭窄或闭塞，从而引起脑组织供血减少或梗死，是一种临床上常见的脑血管疾病之一[1-2]。脑动脉粥样硬化的发生与多种因素有关，包括年龄、饮食、性别、吸烟以及高血压等。在我国，缺血性脑卒中约占脑卒中的74%，其中约46.6%的缺血性脑卒中是由颅内动脉粥样硬化性狭窄而引起，所以脑动脉硬化斑块的早期检出和稳定性判断对预防和治疗脑卒中意义重大[3-4]。磁共振成像技术是一种无创的、可有效评估患者血管壁和动脉斑块稳定性的影像学诊断技术，但高昂的价格使其不能被广泛的应用于脑动脉粥样硬化患者的斑块评估中[5]。C1q坏死因子相关蛋白12(C1q necrosis factor-related protein 12，CTRP12)是一种新发现的脂肪因子，是脂联素保守的旁系同源物。研究[6-7]表明，CTRP12主要参与脂肪细胞合成和分泌，具有广泛的生物学作用，包括抗炎和抑制甘油三酯合成等，被发现可以通过miR-155-5p/LXRα 通路促进胆固醇流出和抑制炎性反应来改善动脉粥样硬化。脂联素(Adiponectin，APN) 是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质。此外，脂联素也是一种胰岛素增敏激素能改善小鼠的胰岛素抗性和动脉硬化症，并被证实与2型糖尿病和冠心病的发展有关，在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力[8]。本研究通过高脂饮食喂养高血压大鼠以建立脑动脉粥样硬化模型，研究脑动脉粥样硬化大鼠血清CTRP12和APN的表达水平，并探讨其表达与磁共振成像技术参数的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验大鼠：30只SD大鼠(6～8周龄，SPF级，雌性，300 g左右)斯贝福(北京)生物技术有限公司[实验动物使用许可证号：SCXK(京)2022-0075]。所有大鼠被适应性喂养1周(自由进食饮水，昼夜各半，22 ℃)后被用于本研究。

1.1.2 试剂与仪器：基础饲料和高脂饲料均购买自北京博奥派克生物科技有限公司；CTRP12酶联免疫试剂盒购自上海瑞番生物科技有限公司(批号202010)；脂联素(APN)酶联免疫试剂盒购自Merck公司(批号RAB1136)；小动物核磁共振成像仪购自苏州纽迈分析仪器股份有限公司(型号NM21-040H-I)。

1.2 研究方法

1.2.1 脑动脉粥样硬化模型制作：参考文献[9]建立高血压、高血脂诱导的脑动脉粥样硬化大鼠模型。两组大鼠均禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉后，在无菌条件下切开腹部皮肤，分离双侧肾动脉，使用手术缝合线以适度的松紧度结扎双侧肾动脉(血液可流动)，造成双侧肾动脉狭窄，即建立高血压模型。正常大鼠血压为85～115 mmHg，造模后血压若≥正常血压20 mmHg且>115 mmHg说明高血压模型制作成功。对照组大鼠仅开腹不结扎双侧肾动脉。术后模型组大鼠给予高脂饲料喂养，而对照组大鼠给予普通饲料喂养，共喂养16周。高脂饲料可造成大鼠高血脂，进而诱导动脉粥样硬化，在高血压基础上，可加速脑动脉粥样硬化形成。当观察到大鼠血管内皮表面粗糙、凹凸不平，细胞排列不齐，内膜的平滑肌细胞增生明显，且与大量堆积的泡沫细胞形成典型的动脉粥样硬化斑块，说明脑动脉粥样硬化大鼠模型造模成功。

1.2.2 头颅磁共振扫描：模型组在术后喂养16后，腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉，使用核磁共振成像仪对所有大鼠大脑中动脉进行整体扫描，将扫描数据上传工作站，并在3D-TOF 原始图及重建图上确定动脉狭窄位置，依此使用软件直接计算大鼠脑动脉斑块个数、斑块厚度和斑块体积。

1.2.3 血清学指标：大鼠在完成头颅磁共振成像扫描后，通过颈椎脱臼法处理所有大鼠，手术切开胸腔，暴露心脏，使用无菌注射器吸取血液3～5 ml，室温条件下1000 g离心10 min以分离血清，使用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇含量，并使用酶联免疫吸附法检测血清CTRP12和APN水平。

1.2.4 血压测量：于术前、术后1周将清醒状态的大鼠置于固定器内，露出鼠尾，于37 ℃水中浸泡30 min，将鼠尾放进套袖，待大鼠安静后充气，测定收缩压，重复3次取平均值。

2 结 果

2.1 两组大鼠血压和血脂水平比较 模型组大鼠收缩压和血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平均显著高于对照组大鼠(均P<0.05)，见表1。

表1 两组大鼠收缩压和血脂指标比较

2.2 两组大鼠血清CTRP12和APN水平比较 模型组大鼠血清CTRP12和APN水平均显著低于对照组正常大鼠(均P<0.05)，见表2。

表2 两组大鼠血清CTRP12和APN水平比较

2.3 血清CTRP12、APN水平与脑动脉粥样硬化大鼠斑块个数相关性 应用磁共振成像技术检测15只脑动脉粥样硬化大鼠脑动脉内斑块个数，并分析其与血清CTRP12和APN相关性，结果显示：脑动脉粥样硬化大鼠脑动脉内斑块个数与CTRP12(r=-0.732，P<0.05)、APN(r=-0.692，P<0.05)水平呈显著负相关，见图1。

图1 脑动脉粥样硬化大鼠斑块个数与血清CTRP12 (左)、APN (右)水平相关性散点图

2.4 血清CTRP12、APN水平与脑动脉粥样硬化大鼠斑块厚度相关性 应用磁共振成像技术检测15只脑动脉粥样硬化大鼠脑动脉内斑块厚度，并分析其与血清CTRP12和APN相关性，结果显示：脑动脉粥样硬化大鼠脑动脉内斑块厚度与CTRP12(r=-0.622，P<0.05)、APN(r=-0.577，P<0.05)水平呈显著负相关，见图2。

图2 脑动脉粥样硬化大鼠斑块厚度与血清CTRP12 (左)、APN (右)水平相关性散点图

2.5 血清CTRP12、APN水平与脑动脉粥样硬化大鼠斑块体积相关性 应用磁共振成像技术检测15只脑动脉粥样硬化大鼠脑动脉内斑块体积，并分析其与血清CTRP12和APN相关性，结果显示：脑动脉粥样硬化大鼠脑动脉内斑块体积与CTRP12(r=-0.732，P<0.05)、APN(r=-0.612，P<0.05)水平呈显著负相关，见图3。

图3 脑动脉粥样硬化大鼠斑块体积与血清CTRP12 (左)、APN (右)水平相关性散点图

3 讨 论

颅内动脉粥样硬化性狭窄(Intracranial atherosclerotic stenosis，ICAS)不仅是缺血性卒中(中风)最常见原因之一，同样也是卒中复发的高风险因素，当前呈现出高发病率及高病死率的特点。流行病学统计数据[10-11]显示，超过一半的东南亚缺血性脑卒中是由ICAS引起，并且ICAS患者不仅终生卒中发病风险升高，而且1年内再发卒中概率可高达20%。此外，研究[12]还指出，无论是症状性ICAS还是无症状ICAS患者，血管风险因素均与其狭窄严重程度、卒中发病风险呈现明显相关性，因此对血管风险因素进行有效管理至关重要。尽管目前多种影像学技术，比如彩超、CT血管造影、数字减影血管造影以及磁共振血管成像等，都可以有效地对血管壁状态和斑块稳定性进行评估，但较高的成本使其不能被推广。因此，筛选出与动脉血管壁状态和斑块稳定性有关的生物标志物意义重大。

本文研究发现，模型组脑动脉粥样硬化大鼠血清CTRP12和APN水平均显著低于对照组正常大鼠，这表明血清CTRP12和APN可能与脑动脉粥样硬化的发生发展有关。进一步分析可知：脂肪因子是由脂肪组织分泌的具有生物活性的细胞因子及激素，与胰岛素抵抗冠状动脉粥样硬化等代谢过程密切相关，CTRP12和APN都是脂肪因子[13]。脂联素是外周血中含量最高的脂肪因子，通过与其受体结合后，通过激活腺苷酸活化蛋白激酶、p38丝裂原活化蛋白激酶和过氧物酶体增殖物激活受体等信号分子发挥抗炎、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化等多种生物学作用[14]。CTRP12作为脂联素的旁系同源物，由信号肽、短N端结构域、胶原样结构域和球状C1q样结构域组成。与脂联素一样，CTRP12也被发现与动脉粥样硬化的发生发展有关，并被发现在与炎性细胞因子和胰岛素抵抗有关的冠状动脉疾病患者血清中表达降低[15-16]。综上并结合本研究结果可知，CTRP12和APN在脑动脉粥样硬化大鼠血清中表达降低，并可能与脑动脉粥样硬化的发展有关。

高分辨磁共振成像(High-resolution magnetic resonance imaging，HRMRI)是当前明确动脉粥样硬化斑块性质最为可靠的无创检查之一，其可以清晰地看到血管壁的情况，尤其对于硬化斑块的形态及组织成分的分析有着较大的优势[17]。此外，HRMRI不仅可以评判出斑块的性质，而且可以判断出斑块分型，并且可以显示斑块形态、斑块体积，可以分析斑块性质、斑块纤维帽、脂质核心大小、斑块钙化、斑块内出血[18-19]。虽然高分辨磁共振成像能较准确地分析斑块的内部组成，是目前判定斑块性质最好的无创检查，但是高分辨磁共振成像对于设备要求较高、检查时间长、价格较为昂贵，这限制了它在临床上的普及。本研究发现，血清CTRP12、APN与磁共振成像技术确定的脑动脉粥样硬化大鼠脑动脉斑块个数、厚度和体积均呈负相关，提示血清CTRP12、APN具有代替磁共振成像技术用于评估脑动脉斑块的潜力。进一步分析可知[15,20]：动脉斑块是由血液中的血脂加上局部炎症细胞等物质沉积在血管壁上而引起动脉血管壁变厚、血管变硬，所以脂质代谢紊乱和慢性炎症在动脉粥样硬化的发病机制中起关键作用。而作为脂肪因子的CTRP12和APN不仅被证实参与脂质代谢调控，而且被发现可通过调控多个信号通路而抑制炎症的发生，所以但CTRP12和APN在血清中的含量减少时，外周血脂代谢将出现异常以及炎症反应增高，进一步导致动脉斑块的形成和发展。

综上所述，脑动脉粥样硬化大鼠血清CTRP12和APN的表达水平降低，并且其与磁共振成像检测的脑动脉斑块个数、厚度和体积均呈负相关，具有代替磁共振成像技术用于评估脑动脉斑块的潜力。