LncRNA HOXC13-AS靶向miR-634对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响

张英 刘宇 晁利娜

(新乡市中心医院产科，河南 新乡 453000)

子宫内膜癌是妇科疾病中常见恶性肿瘤之一，其主要是一种发生于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，关于其发病机制尚未阐明，绝大部分子宫内膜癌患者有较差且死亡率较高〔1〕。越来越多的实验表明，异常表达的长链非编码(Lnc)RNA可以作为癌症诊断的生物标志物和潜在的治疗靶点， 此外，部分LncRNA已被证实可参与调控子宫内膜癌细胞增殖、分化、迁移等生物学过程〔2，3〕。研究表明长链非编码RNA HOXC13-AS(LncRNA HOXC13-AS)在肝癌组织中上调表达，并可参与肝癌发生发展过程〔4〕。HOXC13-AS在乳腺癌组织中高表达，上调乳腺癌细胞中的HOXC13-AS含量可加速癌细胞的增殖〔5〕。然而，关于子宫内膜癌中HOXC13-AS的表达功能和机制尚未可知。通过starBase预测发现微小RNA-634(miR-634)含有HOXC13-AS的互补序列。miR-634在胰腺癌中表达下调，过表达miR-634抑制胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭，及诱导凋亡〔6〕。此外，miR-634在宫颈癌细胞中过表达可破坏癌细胞增殖、侵袭及迁移〔7〕。但是，HOXC13-AS是否通过调节miR-634在子宫内膜癌发挥作用尚未完全阐明。因此，本实验探讨HOXC13-AS与miR-634在子宫内膜癌中的具体作用及其机制，进一步探究HOXC13-AS与miR-634之间的调控关系及其对子宫内膜癌细胞的生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 美国ATCC细胞库提供子宫内膜癌细胞株Ishikawa；美国Gibco公司提供杜氏改良培养基(DMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清；美国Thermo Fisher公司提供Lipofectamine2000；广州锐博生物科技提供乱序无意义阴性对照序列(si-NC)、HOXC13-AS小干扰RNA(si-HOXC13-AS)、阴性对照(miR-NC)、miR-634 模拟物；上海吉玛制提供miR-634特异性寡核苷酸抑制剂 (anti-miR-634)及其阴性对照；pcDNA3.1购自上海索宝生物；噻唑蓝(MTT)购自上海泽叶生物；美国BD公司提供膜联蛋白V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)试剂、Matrigel基质胶；美国Corning公司提供Transwell小室；双荧光素酶报告载体及检测试剂盒购自美国Promega公司；山羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，一抗均购自美国Cell Signaling Technology公司。组织标本：收集20对于2017年3月至2018年5月新乡市中心医院进行手术治疗的子宫内膜癌患者的癌组织及癌旁组织，年龄46～60岁，并置于-80 ℃保存。患者均经病理确诊。本研究已经过医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1细胞转染及分组 取生长状态良好的Ishikawa细胞参照Lipofectamine2000进行转染，按照随机数字表法随机分为si-NC组(si-NC转染至Ishikawa细胞)、si-HOXC13-AS组(si-HOXC13-AS转染至Ishikawa细胞)、miR-NC组(miR-NC转染至Ishikawa细胞)、miR-634组(miR-634 mimics转染至Ishikawa细胞)、si-HOXC13-AS+anti-miR-NC组(si-HOXC13-AS与anti-miR-NC共转染至Ishikawa细胞)、si-HOXC13-AS+anti-miR-634组(si-HOXC13-AS与anti-miR-634共转染至Ishikawa细胞)。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR) 采用Trizol法提取组织及细胞总RNAs，根据反转录试剂盒说明书合成cDNAs， 随后最后采用qRT-PCR检测 HOXC13-AS(内参GAPDH)和miR-634(内参U6)的相对表达量。

1.2.3MTT 将对数期生长的Ishikawa细胞接种到96孔板中。 将细胞在 37℃培养24、48、72 h后每孔加入20 μl MTT溶液孵育4 h。弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)室温孵育1 h ，然后在490 nm下测量每个孔中的吸光度值。

1.2.4流式细胞术 将各组Ishikawa细胞重悬于500 μl 1×结合缓冲液中，随后与5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI室温避光孵育10 min， 最后通过流式细胞术对样品凋亡进行分析。

1.2.5Transwell 将各组对数期生长的Ishikawa细胞重悬于不含血清的DMEM培养液中制备成单细胞悬液。取200 μl细胞悬液置于Transwell 室上室中〔Matrigel基质胶涂层(40 μl/孔)用于侵袭检测和未涂层用于迁移检测〕， 随后将600 μl含有10%胎牛血清的培养基添加到下室中。 培养24 h后，PBS洗涤，通过膜的细胞用0.1%结晶紫染液染色10 min，然后显微镜下观察计数。

1.2.6双荧光素酶报告实验 starBase预测显示HOXC13-AS的序列中含有与miR-634互补的核苷酸序列。将含有miR-634结合位点或位点突变序列的HOXC13-AS片段克隆到荧光素酶载体中构建野生型(WT)或突变型(MUT)荧光素酶报告载体(WT/MUT-HOXC13-AS)。随后分别将上述重组质粒与miR-NC、miR-634 mimics共转染至Ishikawa细胞，24 h后检测荧光素酶活性。

1.2.7Western印迹检测 采用蛋白裂解液(1 ml RIPA、1% PMSF、0.1% 抑肽酶)提取细胞总蛋白。BCA法检测蛋白浓度后，30 μg蛋白通过10%十二烷基硫酸钠聚乙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并将蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h后，该膜在4℃条件下与一抗(1∶1 000)孵育12 h，随后在室温条件下与二抗(1∶5 000)孵育1 h。采用电化学发光(ECL)试剂盒检测蛋白信号，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0统计学软件进行t检验或单因素方差分析。

2 结 果

2.1LncRNA HOXC13-AS和miR-634在子宫内膜癌组织中表达 HOXC13-AS在子宫内膜癌组织中表达显著高于癌旁组织(P<0.05)，而miR-634的表达显著低于癌旁组织(P<0.05)，见表1。

表1 LncRNA HOXC13-AS和miR-634在子宫内膜癌组织中的表达

2.2抑制HOXC13-AS表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、凋亡的影响 相对于si-NC组，si-HOXC13-AS组HOXC13-AS表达水平显著降低(P<0.05)。敲低HOXC13-AS降低Ishikawa细胞活力和促进细胞凋亡(P<0.05)，此外，下调Ishikawa细胞中HOXC13-AS表达抑制细胞周期蛋白(Cyclin)D1和B细胞淋巴瘤(Bcl)-2的蛋白表达并促进p21和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白含量 (P<0.05)，见表2、图1。

表2 抑制HOXC13-AS表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、凋亡的影响

2.3抑制HOXC13-AS表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞迁移、侵袭的影响 与si-NC组比较，si-HOXC13-AS组Ishikawa细胞迁移与侵袭能力降低并伴随着基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表达含量的下降(P<0.05)，见图2、表3。

2.4miR-634过表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 相较于miR-NC转染，miR-634 mimic转染显著升高Ishikawa细胞中miR-634的含量(P<0.05)；功能实验表达，miR-634过表达抑制细胞活力，迁移和侵袭，促进细胞凋亡 (P<0.05)；此外，miR-634 mimic转染升高p21和Bax蛋白表达，降低CyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05)，见表4、图3、表5、图4。

图1 抑制HOXC13-AS表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、凋亡的影响

图2 迁移侵袭相关蛋白表达及抑制HOXC13-AS表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞迁移、侵袭的影响(结晶紫染色，×200)

表3 抑制HOXC13-AS表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞迁移、侵袭的影响

2.5LncRNA HOXC13-AS靶向调控miR-634的表达 HOXC13-AS与 miR-634互补序列见图5。与miR-NC、WT-HOXC13-AS共转染组比较，miR-634 mimics、WT-HOXC13-AS共转染组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；miR-NC、MUT-HOXC13-AS共转染组与miR-634 mimics、MUT-HOXC13-AS共转染组荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。此外，HOXC13-AS过表达抑制细胞中miR-634的表达含量，而HOXC13-AS下调促进细胞中miR-634的表达(P<0.05)，见表6。

表4 miR-634过表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

图3 细胞凋亡流式图及miR-634过表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡、迁移、侵袭的影响(结晶紫染色，×200)

表5 miR-634过表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

图4 两组蛋白电泳

2.6干扰miR-634表达逆转抑制HOXC13-AS对子宫内膜癌Ishikawa细胞的作用 HOXC13-AS沉默上调了miR-634表达，但是miR-634低表达减弱了此影响。同样地，miR-634低表达抑制了si-HOXC13-AS对Ishikawa细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用和对凋亡的促进作用。HOXC13-AS沉默在Ishikawa细胞中抑制了CyclinD1,Bcl-2,MMP-2和MMP-9的蛋白表达但促进了p21和Bax的蛋白表达；然而，si-HOXC13-AS和anti-miR-634的共转染减弱了HOXC13-AS沉默引起的这些效应。见表6、表7、图6和图7。

图5 HOXC13-AS与miR-634的互补序列互补的核苷酸序列

表6 干扰miR-634表达逆转了抑制HOXC13-AS对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用

表7 干扰miR-634表达逆转了抑制HOXC13-AS对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭相关蛋白表达的作用

图6 细胞凋亡流式图、干扰miR-634表达逆转了抑制HOXC13-AS对子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡、迁移、侵袭的作用(结晶紫染色，×200)

1～4：si-NC、si-HOXC13-AS、si-HOXC13-AS+anti-miR-NC、si-HOXC13-AS+anti-miR-634图7 4组蛋白电泳

3 讨 论

子宫内膜癌早期症状隐匿导致早期诊断效率降低，患者术后易复发且化疗敏感性降低导致子宫内膜癌患者死亡率逐年升高〔8〕。因而基于子宫内膜癌细胞的生物学特性寻找新的治疗靶点有助于提高子宫内膜癌诊断及治疗水平。有研究表明LncRNA在子宫内膜膜中发挥重要调控作用， LncRNA可通过充当miRNA竞争性内源RNA在子宫内膜癌的病理进展中发挥作用〔9，10〕。因而深入探究LncRNA-miRNA调控机制可为子宫内膜癌早期诊断及预后判断提供新的生物标志物，并可为子宫内膜癌治疗提供新的潜在靶点。

HOXC13-AS可促进神经胶质瘤的迁移及侵袭〔11〕。研究表明，HOXC13-AS通过调节miR-383-3p/HMGA2分子轴促进鼻咽癌细胞增殖及侵袭〔12〕。相关报道指出HOXC13-AS高表达与胆管癌患者预后不良有关〔13〕。但HOXC13-AS在子宫内膜癌中的表达尚未可知。本研究结果提示，HOXC13-AS的表达量升高可能促进子宫内膜癌的发生。抑制HOXC13-AS降低子宫内膜癌细胞活力显著降低，提示HOXC13-AS可能通过促进子宫内膜癌细胞增殖而参与其发生过程。研究表明，CyclinD1在多种肿瘤中均呈高表达，并可通过正向调控细胞周期促进细胞生长，p21可抑制CyclinD1与细胞周期依赖蛋白激酶的结合从而诱导细胞周期阻滞于G0/G1期，抑制细胞生长〔14〕。本研究发现，敲除HOXC13-AS可抑制子宫内膜癌细胞中CyclinD1的表达但是升高p21的表达。Bcl-2蛋白家族可参与细胞凋亡过程，其中Bcl-2属于抗凋亡蛋白，Bax属于促凋亡蛋白〔15〕。本研究进一步发现，HOXC13-AS敲除后，子宫内膜癌细胞凋亡率显著升高，同时细胞中Bax的表达水平显著升高而Bcl-2的表达水平明显减低。MMP-2和MMP-9是一种含锌的金属蛋白酶，具有广泛的底物特异性，可参与细胞外基质降解从而促进细胞转移，已有研究发现 MMP-2和MMP-9可参与子宫内膜癌浸润及转移过程〔16〕。本研究发现，下调HOXC13-AS伴随着细胞迁移侵袭的抑制及MMP-2和MMP-9表达水平的显著下降。综上，抑制HOXC13-AS可能通过下调相关蛋白的表达从而破坏子宫内膜癌细胞的生长和转移。

在舌鳞状细胞癌中miR-634呈低表达，上调miR-634的表达可抑制circ_0001742的促癌作用〔17〕。研究表明，miR-634可抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭〔18〕。LncRNA DANCR通过充当miR-634的海绵分子从而促进神经胶质瘤的发生〔19〕。相关报道指出miR-634通过靶向抑制Rab1A和DHX33的表达抑制肝细胞癌的发展〔20〕。本研究提示，miR-634可能参与子宫内膜癌发生发展过程。随后，本研究证明miR-634是HOXC13-AS的直接靶标，HOXC13-AS负向调节miR-634在子宫内膜癌细胞中的表达。 重要的是，通过一系列回复实验，证明抑制miR-634可以逆转HOXC13-AS在子宫内膜癌细胞中促凋亡，抗迁移和抗侵袭的能力。

综上，HOXC13-AS在子宫内膜癌中呈高表达，miR-634在子宫内膜癌中呈低表达，HOXC13-AS通过靶向抑制miR-634表达从而促进子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭，抑制细胞凋亡，可为子宫内膜癌诊断提供新的分子标志物，并可为子宫内膜癌的治疗提供潜在靶点。