瘦素及其受体在乳腺癌中的作用及机制

张建军 匡文洋 郭小靖 龙晓彬

(吉安市中心人民医院肿瘤科，江西 吉安 343000)

乳腺癌属于临床常见恶性肿瘤，主要发生在女性群体中，近年呈现发病率升高趋势。已有报道指出，肥胖是导致乳腺癌发病的危险因素之一，特别是在绝经后女性中，其与乳腺癌预后存在密切联系〔1〕。瘦素是由肥胖基因编码表达的小分子蛋白，又被称为肥胖抑素，属于重要的脂肪细胞因子〔2〕。在正常乳腺组织中，瘦素及其受体呈低表达状态，但在乳腺癌中呈高表达状态，因此，越来越多的学者认为瘦素及其受体与乳腺癌发生、发展存在密切联系〔3〕。本研究通过对新辅助化疗乳腺癌患者瘦素及其受体表达情况进行分析，探究瘦素及其受体与乳腺癌疗效、预后之间的关系及作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取吉安市中心人民医院2017年1月至2020年1月收治的乳腺癌患者328例，在经根治性手术治疗后均接受新辅助化疗干预后分为无变化组(224例)、完全缓解组(64例)、进展组(40例)，患者年龄61～76岁，平均(69.7±5.4)岁；其中男7例，女321例；HR阳性患者124例，HER2阳性患者137例，三阴性患者67例；临床分期：Ⅰ期54例，Ⅱ期132例，Ⅲ期142例；肿瘤分期：T1期210例，T2期94例，T3期22例，T4期2例。在手术标本中评估新辅助化疗后病理反应，乳腺癌原发灶及腋窝淋巴结均无浸润性癌定义为完全缓解。纳入标准：①入组均为乳腺癌患者，且均经穿刺活检证实；②患者均接受根治性手术治疗；③患者无其他部位的恶性肿瘤；④对于本研究知情并同意。排除标准：①患者疾病控制不理想，存在生命危险；②患者临床资料缺失；③患者存在精神障碍或沟通障碍。本次研究已获得医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1病理切片制备 对所有入组患者术前粗针穿刺组织样本进行收集，制成厚度约4 μm的组织切片，贴于载玻片上进行过夜，温度为67℃。

1.2.2免疫组化染色肿瘤切片 对载玻片进行脱蜡、脱水处理，然后使用磷酸盐缓冲液(PBS)进行3次冲洗，每次5 min，使用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，反应结束后弃柠檬酸钠缓冲液，使用PBS进行3次冲洗，每次5 min。依次加入一抗、二抗，反应结束后进行二氨基联苯胺(DAB)显色，取经辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素加入样本中进行30 min孵育，使用PBS进行冲洗3次，每次3 min，滴加儿氨基苯胺溶液，显微镜下对显色情况进行观察。复染选择苏木素，浸泡10 s后进行PBS冲洗。经脱水处理后进行封片。

1.2.3观察瘦素及其受体表达情况 瘦素及其受体染色后呈现棕黄色或黄色，本研究为保证统计结果准确性，由两名医师进行判定，每个样本取5个视野，观察其染色位置，染色位置位于细胞膜的为瘦素受体，染色位置位于细胞膜及细胞质的为瘦素。采用半定量法进行分析，根据着色比例进行评分，占比10%及以上均为阳性，低于10%为阴性，阴性为0分，10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，75%以上为4分。根据染色情况进行记分，无染色为0分，浅黄色为1分，深黄色为2分，棕褐色为3分。最终得分为阳性细胞占比与染色强度的乘积，并根据所得分数进行等级划分，9分及以上为强阳性，以“”表示；6～8分为阳性，以“”表示；3～5分为弱阳性，以“+”表示；2分及以下为阴性，以“-”表示。

1.2.4细胞培养 选择MCF-7细胞及MDA-MB-231细胞进行细胞复苏，将所选细胞加入含胎牛血清的培养基中，培养环境为5%浓度的二氧化碳，37℃，培养一段时间后进行细胞传代，当细胞密度在90%及以上时进行细胞传代，弃培养液，洗涤贴壁细胞，加入胰酶进行消化，确定细胞分离后加入胎牛血清培养液，培养环境为5%浓度的二氧化碳，温度为37℃。

1.2.5细胞病毒感染 取胎牛血清培养液对提前制备好的细胞进行重悬，观察密度在80%以上时进行传代培养，慢性病毒感染时需选择生长状态良好细胞。选择对数细胞进行胰酶消化处理，将制成的悬液进行继续培养，在进行病毒感染时需确定细胞数目，更换感染培养基，在感染8～12 h后更换常规培养基。观察感染情况，获取感染率70%以上状态良好的细胞进行后续试验。

1.2.6荧光定量聚合酶链反应(PCR) 取培养好的细胞进行RNA提取，高速离心处理，分离上层清液后加入乙醇，再次高速离心处理，分离后加入乙醇再次进行离心处理，弃废液后加入试剂进行再次离心，经多次离心处理后分离获得RNA。将制备好的RNA进行反转录处理，获得cDNA，定量测定目的基因。制备敲减核转录因子抑制蛋白激酶(IKK)β细胞，将敲减IKKβ细胞作为研究组，与敲减细胞(对照组)进行对照分析。

1.3统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t检验、秩和检验、Pearson相关性分析。

2 结 果

2.13组瘦素及其受体表达情况 与完全缓解组相比，进展组瘦素“”表达占比明显降低(P<0.05)，瘦素受体“”表达占比明显降低(P<0.05)，见表1。不同表达程度免疫组化染色，见图1。

表1 3组瘦素及其受体表达情况对比〔(n)%〕

图1 完全缓解组与进展组瘦素受体表达情况(免疫组化染色，×400)

2.2不同分子分型患者瘦素及其受体表达情况 HR阳性患者完全缓解组瘦素受体“”表达占比明显高于进展组(P<0.05)；HER2阳性患者完全缓解组瘦素“”表达占比明显高于进展组(P<0.05)，HER2阳性患者完全缓解组瘦素受体“”表达占比明显高于进展组(P<0.05)，瘦素受体“-、+、”表达占比明显低于进展组(P<0.05)。三阴性患者完全缓解组瘦素受体“+”表达占比明显低于进展组(P<0.05)，见表2。与HR阳性患者相比，三阴性患者、HER2阳性患者瘦素及其受体表达“”表达占比明显升高(P<0.05)，见表3。

表2 不同分子分型患者完全缓解组、进展组瘦素及其受体表达情况对比〔(n)%〕

表3 不同分子分型患者瘦素及其受体表达情况对比〔(n)%〕

2.3各成分在MCF-7及MDA-MB-231细胞中表达情况对比 研究组瘦素及其受体在MCF-7细胞中的表达明显低于对照组(P<0.05)，在MDA-MB-231细胞中的表达无差异(P>0.05)；研究组核转录因子(NF)-κB通路相关基因IKBKG、P65在MCF-7细胞中的表达明显低于对照组，在MDA-MB-231细胞中的表达明显高于对照组(P<0.05)；研究组缺氧诱导因子(HIF)在MCF-7细胞中的表达明显低于对照组(P<0.05)，在MDA-MB-231细胞中的表达无差异(P>0.05)，见表4。

表4 各成分在MCF-7及MDA-MB-231细胞中表达情况对比

3 讨 论

瘦素属于脂肪因子，在与其受体结合时需要通过多种信号通路完成，在糖尿病、肿瘤、心血管疾病及肥胖等多种疾病发生、发展中均有参与〔4〕。瘦素与其受体呈正相关性表达，正常情况下可调节机体能量代谢、生长繁殖等，但是在病理情况下可影响多部位肿瘤生长〔5〕。已有研究指出，肥胖与结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、食道癌等多种肿瘤发生存在密切联系，并且将肥胖作为绝经后女性乳腺癌发病的危险因素〔6〕。在正常乳腺中瘦素及其受体呈低表达状态，但乳腺癌组织中瘦素及其受体表达明显升高，由此可以看出，在乳腺癌发生及预后中瘦素及其受体起到非常关键的作用〔7〕。

已有大量研究指出，肥胖会降低乳腺癌预后。有报道指出，接受新辅助化疗治疗的乳腺癌患者肥胖者完全缓解率低于非肥胖患者〔8〕。也有研究指出，肥胖会降低乳腺癌患者化疗病理完全应答率，影响预后〔9〕。虽然关于瘦素在肿瘤患者中呈高表达状态的研究相对较多，但是对于其与肿瘤患者预后之间关系的结论并不统一〔10〕。本研究推测，瘦素及其受体可影响患者新辅助化疗疗效，提高肿瘤组织化疗敏感性。有研究中指出，HER2高表达的乳腺癌SK-BR-3细胞系中，瘦素可通过相关途径反式激活HER2〔11〕。因此，认为瘦素及其受体与HER2存在相互促进作用，从而提高化疗敏感性。

近几年，关于NF-κB与肿瘤微血管形成之间关系的研究一直都是医学热点。有学者指出，NF-κB活性在食管鳞状细胞癌中明显升高，促进血管表皮生长因子表达〔12〕。也有报道指出，肿瘤微血管密度与NF-κB表达存在密切联系，胃癌组织中存在肿瘤微血管密度及NF-κB表达升高情况，认为NF-κB可促进肿瘤新生血管的形成〔13〕。HIF-1属于当今临床化疗的常用靶点，已证实HIF水平与肿瘤进展、转移有着密切联系，而且HIF属于瘦素及血管上皮生长因子的上游调节因子，对于瘦素水平可以起到调节作用〔14〕。有报道指出，HIF上游基因为NF-κBp65，可维持HIF活性〔15〕。分析产生本研究结果的原因，认为其可能与瘦素及其受体表达水平有关，但是本次研究并不能直接证实其中的关系，还需进一步研究对相互之间作用机制进行分析。

综上，在乳腺癌预后评估过程中，瘦素及其受体有着非常高的应用价值，猜测乳腺癌患者瘦素及其受体表达可能与NF-κB通路中IKKβ有关。