五味子葛根复合饮料的工艺研究

王碧涵，杨 波，林程程，董 阳，李正祎，孙靖辉，李 贺，陈建光，王春梅*

(1.北华大学药学院药理教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院检验学院,吉林 吉林 132013)

五味子为木兰科植物五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)的干燥成熟果实，是最早列于《神农本草经》的上品中药，含有木脂素、挥发油、有机酸、多糖等多种化学成分，药用价值极高[1]。众多研究表明，五味子具有保肝、抗炎、抗氧化、降糖降脂等多种功效[2]。本课题组前期已经证实五味子多糖对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠、高脂饮食联合链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠均具有显著的调节血脂作用，是五味子发挥降脂作用的主要成分之一[3]。

葛根为豆科植物野葛(Puerarialobata(Willd.)Ohwi)的干燥根，是中国最早使用的草药之一[4]，富含异黄酮、异黄酮苷、香豆素以及-2烯内酯及其衍生物等，具有心血管保护、神经保护、预防冠心病、降低高血压等作用[5-6]。Yan等[7]研究表明，葛根素可降低高脂血症大鼠血清和肝脏中甘油三酯、胆固醇水平；Zheng等[8]发现葛根素可通过减少血清瘦素水平，上调P-JAK2、P-STAT3表达，降低NAFLD大鼠血脂水平，这些结果表明葛根素有着很高的利用价值。

近年来，随着我国经济的快速发展，人们生活方式的改变，高脂血症的发病率逐年升高。据统计，我国约有1.6亿高脂血症患者。由于多数患者在发病初期没有明显症状，使得高脂血症的知晓率、就诊率和治疗率都比较低。然而长期的血脂升高是导致心脑血管疾病和脂肪性肝病的重要原因，被称之为“生命第一隐形杀手”。因此，研究和开发作用缓和、具有整体调节作用的中药类功能保健品具有重要意义。本研究在前期工作基础上，依据中医药理论，以五味子和葛根为主要原料，辅以具有降脂作用的黄芪、山楂，添加适量甜菊糖苷及山梨酸钾，开发具有舒适口感的辅助降血脂功能的五味子葛根复合饮料，可为广大患者提供新的选择。

1 材料与方法

1.1 实验材料

五味子、葛根、黄芪、山楂(河北省安国药材市场)；葛根素对照品(四川省维克奇生物科技有限公司)；山梨酸钾、甜菊糖苷(食品级，河南万邦实业有限公司)；无水乙醇(天津市致远化学试剂有限公司)；高效液相色谱级甲醇(美国天地有限公司)。

LC-2010A高效液相色谱仪(岛津国际贸易有限公司)；RE-52旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；KDM型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；QL-861旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2 五味子葛根复合饮料工艺流程

五味子、葛根、黄芪、山楂→粉碎→水煎煮→过滤→浓缩→醇沉→抽滤→回收乙醇→滤液+甜菊糖苷、山梨酸钾→灌装→灭菌→成品。

1.3 葛根素含量的测定

采用高效液相色谱法，以葛根素标准品为对照品进行测定[9]。将葛根素对照品20 mg溶于少量70%甲醇，混匀，配制0.2 g/L葛根素对照品溶液，将其分别稀释至浓度5、10、20、30、40、50 mg/L，备用。精密称取0.5 g样品溶解在10 mL蒸馏水中，混匀后4000 r/min离心5 min，取1 mL上清液上大孔吸附树脂层析柱，分次少量打入40 mL蒸馏水洗脱，流速为1 mL/min，再分次少量打入50 mL 70%甲醇洗脱葛根素，将洗脱液置于蒸发皿中，沸水浴至近干，用70%甲醇将其溶解并定容至1 mL，过0.45 μm滤膜，进行色谱分析。色谱柱：LC-2010A C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶水=25∶75，流速1 mL/min，检测波长为247 nm，进样体积10 μL，柱温30 ℃。

1.4 单因素试验

称取五味子10 g、葛根25 g、黄芪50 g、山楂20 g，粉碎，以水做提取溶剂，合并滤液并蒸发至浸膏，按照“1.3”方法测定浸膏中葛根素含量，并以其为指标，进行单因素试验，考察的因素水平为料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14(g/mL)，提取时间1、2、3、4、5 h，提取次数1、2、3、4、5次。

1.5 正交试验

根据单因素试验结果，进行正交试验L9(33)设计，以葛根素含量作为评价标准，确定五味子葛根复合饮料的最佳水提工艺。因素与水平见表1。

表 1 正交试验因素与水平表

1.6 醇沉浓度与醇沉时间的考察

按正交试验确定的工艺进行提取，将滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20(60 ℃)，得到浓缩液。取浓缩液50 mL，共9份，加入无水乙醇，使其含醇量分别达到60%、70%、80%，静置时间分别为18、24、48 h。抽滤，得到滤液[10]，分别测得9份样品中葛根素含量，确定五味子葛根复合饮料的最佳纯化工艺。

1.7 感官评定

由10人组成感官评价小组，采取20分制，每人通过视觉、嗅觉、味觉分别评价保健茶的色泽、气味、口味、状态，评分标准见表2，10人的平均分作为最终结果[11-12]。

1.8 甜菊糖苷剂量的考察

按最佳醇沉浓度与时间对浓缩液进行纯化，加入适量纯化水稀释，分别加入0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.40%甜菊糖苷[13]，依据感官评分标准进行打分。

表 2 感官评分标准

1.9 山梨酸钾剂量的考察

取5份加入最佳甜菊糖苷剂量的稀释后纯化浓缩液，依次加入0.01%、0.02%、0.04%、0.08%、0.1%山梨酸钾防腐剂，依据感官评分标准对样品进行打分。

1.10 pH测定

酸度计用pH为4.01、6.86的标准缓冲液校正后，放入调配好的五味子葛根复合饮料的液面以下，等待几分钟至pH计上的数字不再变化，记录3次的平均值。

2 结果与分析

2.1 葛根素的标准曲线

葛根素标准曲线如图1所示。葛根素标准曲线的线性回归方程Y=38 539X+17 629R2=0.998 7。

图 1 葛根素标准曲线

2.2 单因素试验结果

五味子葛根复合饮料提取工艺单因素试验结果见图2。由图2(A)可知，随着加水量的增多，葛根素含量也逐渐增加，当料液比在1∶10之后时，葛根素含量呈下降趋势，因此为节约提取溶剂的剂量，选取最佳料液比为1∶10(g/mL)。由图2(B)所示，随着提取时间的延长，葛根素含量也逐渐增加，当提取时间超过2 h时，葛根素含量基本不变，因此为节省时间，选取最佳提取时间为2 h。由图2(C)所示，随着提取次数的增多，葛根素含量也逐渐增加，当提取次数超过3次时，葛根素含量呈下降趋势，因此最佳提取次数为3次。

图 2 料液比、提取时间、提取次数对葛根素含量的影响

2.3 正交试验结果

五味子葛根复合饮料提取工艺正交试验结果见表3。由表3可知，根据极差大小分析影响葛根素含量的因素顺序依次为：料液比>提取次数>提取时间。通过表4方差分析可知，料液比和提取次数对葛根素含量的影响具有显著性差异。综上判断，得到最佳提取条件为：A2B2C3，即料液比为1∶10，提取时间为2 h，提取次数为3次。

表 3 五味子葛根复合饮料提取工艺正交试验结果

表 4 五味子葛根复合饮料提取工艺方差分析表

2.4 醇沉浓度与醇沉时间的考察结果

五味子葛根复合饮料醇沉浓度与醇沉时间考察结果见表5。由表5可知，当药液中醇沉浓度达到70%，且静置时间为24 h时，该饮料中葛根素含量最高，且提取液颜色适中。最终确定纯化条件为：醇沉浓度70%，静置时间24 h。

表 5 醇沉浓度与醇沉时间考察结果

2.5 甜菊糖苷剂量的确定

如表6所示，当甜菊糖苷用量为0.01%～0.02%时，感官评价小组认为饮料口感偏酸，五味子酸味偏重；当甜菊糖苷用量为0.003%～0.04%时，饮料口感偏甜，药味偏淡；当甜菊糖苷用量为0.025%时，饮料口感适中，且富有复合五味子淡香味，适合大多数人饮用，因此最终确定甜菊糖苷用量为0.025%。

表 6 甜菊糖苷对口感影响的评分结果

2.6 山梨酸钾剂量的确定

加入不同剂量的山梨酸钾，口感没有明显差别。考虑到食用安全，根据GB2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定最大使用量为0.5 g/kg[14]，最终确定加入0.02%山梨酸钾。

2.7 pH测定

通过pH计测定，样品pH为4.8，且味道较好，符合2020《中国药典》标准。

2.8 饮料中葛根素含量的测定结果

将最佳制备工艺得到的峰面积带入到葛根素标准曲线的线性回归方程中，最终得到饮料中葛根素含量为0.76 g/100 mL。

3 结 论

本研究以五味子、葛根、黄芪、山楂为主要原料制备五味子葛根复合饮料。通过单因素试验和正交试验，以葛根素含量作为评价指标，确定复合饮料的最佳水提条件为料液比1∶10(g/mL)、提取时间为2 h、提取次数为3次。同样以葛根素含量为评价指标，通过对复合饮料的醇沉时间与醇沉浓度的考察，确定了最佳纯化条件为醇沉浓度70%、醇沉时间24 h。以感官评分作为评价依据，确定复合饮料的最终成型工艺，即加入0.025%甜菊糖苷和0.02%山梨酸钾，最终进行灭菌处理。由此调配的五味子葛根复合饮料呈褐色，无杂质，有淡淡的五味子风味，pH 4.8，葛根素含量为0.76 g/100mL。