香烟烟雾提取物诱导16HBE细胞MUC5AC上调的机制

田晨 刘志辉 孟繁荣 李华 何湘蓉 胡锦兴

1广州医科大学研究生院（广州 510120）；2广州市胸科医院肺研所（广州 510120）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）又称为慢阻肺，是目前全球三大死因之一，长期接触有害气体或颗粒导致患者小气道发生气道炎症、气道重塑及气道黏液阻塞是促使COPD 患者逐渐气流受限的主要因素［1-2］。吸烟导致患者黏液高分泌是致使COPD 黏液阻塞的主要发病机制之一，而治疗黏液高分泌被认为可以改变患者预后。在COPD 患者中，离子-流体运输及高分泌的病理性黏蛋白MUC5AC 导致黏液高度浓缩、黏液运输失败，小气道中的黏液无法被咳嗽清除，形成气道堵塞，促使气流受限发生，但该过程发生发展的分子机制尚不完全清楚［3-5］。本研究基于细胞水平，通过转录组测序技术筛选出香烟烟雾提取物（CSE）刺激人支气管上皮细胞后差异表达基因（DEGs），并通过生物信息学分析方法进行数据挖掘，筛选出可能参与该过程中MUC5AC 上调的信号通路并加以验证，以期为COPD 黏液高分泌分子机制研究提供数据支持，并为寻找新的COPD 药物作用靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料人支气管上皮细胞16HBE（广州呼吸健康研究所的馈赠），红双喜牌香烟（广东中烟工业有限责任公司），高糖型DMEM 培养基（Gibco），胎牛血清（Gibco），双抗溶液（Gibco），胰蛋白酶-EDTA（0.25%）（Gibco），总RNA 提取试剂盒（ESscience），High Capacity cDNA 反转录试剂盒（Applied Biosystems），SYBR Green Pro Taq HS（AG），WNT 信号通路激活剂CT99021 monohydrochlo ride（Med-ChemExpress），Opti-MEM 培养基（Gibco），Lipofectamin 3000（Thermo Fisher Scientific）。超微量分光光度计（Thermo Scientific），VIIA7 实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 CSE 制备将4 支除去了滤嘴的红双喜牌香烟燃烧的烟雾以20 mL/min 速度抽吸入20 毫升PBS 溶液。利用4%NaOH 和10%HCl 溶液将pH 值调节至7.4，使用0.22 微米过滤器过滤和除菌，将收集的混合液定义为100%CSE。

1.2.2 细胞准备从液氮中取出16HBE 细胞进行复苏并接种于培养瓶中，以含5%胎牛血清及1%双抗的DMEM 完全培养基进行培养。当细胞密度达到80% ～90%时去除培养基，加入消化酶进行消化，并按1∶3 的比例传代。实验取生长状态良好的16HBE 细胞以5%CSE 刺激24 h。

1.2.3 转录组测序

1.2.3.1 提取总RNA 送检测序收集三次实验组（5%CSE 刺激16HBE 细胞24 h）与对照组（PBS 培养16HBE 细胞24 h）细提取其总RNA，使用超微量分光光度计检测总RNA 浓度及质量，按送检要求稀释后交由北京六合华大基因科技有限公司完成质检并进行转录组测序。

1.2.3.2 测序结果质控使用DNBSEQ 平台测序，将测序所得的raw reads 通过SOAPnuke 软件进行质控，去除包含接头、未知碱基N 含量大于5%以及低质量的reads（质量值低于15 的碱基占该reads 总碱基数的比例大于20%）以得到Clean reads ，过滤后的Clean Reads 保存为FASTQ 格式，使用HISAT软件将Clean reads 比对到参考序列并得到各基因的表达量，以FPKM 标准化表达量，参考序列来自NCBI 的Homo_sapiens（GCF_000001405.39_ GRCh38.p13）。比对后通过统计比对率等，进行第二次质控。

1.2.3.3 筛选差异基因进行分析将CSE 组与对照组基因差异表达倍数（FC）取以2 为底的对数值，定义log2（FC）＞1，校正后Q 值＜0.05 的基因为DEG，使用Dr.Tom 软件进行基因定量分析、以筛选出差异表达基因（DEG），对DEG 进行聚类热图及火山图分析总览DEG分布情况、差异大小及差异显著性等信息；对DEG 进行GO 功能注释、KEGG pathway 功能注释，根据注释结果筛选出信号传导相关的DEG 进行GO_Biological Process 及KEGG pathway富集分析，寻找可能与CSE诱导的MUC5AC上调相关的信号通路。将可能相关的信号通路DEGs 进行KDA 分析，筛选出KDA 基因及初始基因进行验证。

1.2.4 激活经典WNT 信号通路分组及处理措施为：激动剂+CSE 组给与经典WNT 信号通路激活剂及5%CSE 刺激；激动剂组给予经典WNT 信号通路激活剂；CSE 组给予5%CSE 刺激；对照组给予PBS 缓冲液。

1.2.5 siRNA 干扰WNT 基因

1.2.5.1 实验分组实验分为6个组：siRNA+CSE组（分别转染WNT4/WNT5B/WNT6/WNT9A/WNT10A siRNA，均给予5%CSE 刺激）；siRNA 组（分别转染WNT4/WNT5B/WNT6/WNT9A/WNT10A siRNA）；阴性对照+CSE 组（转染非特异性siRNA，给予5%CSE刺激）；阴性对照组（转染非特异性siRNA，给与PBS 缓冲液）；CSE 组（给予5%CSE 刺激）；空白对照组（给予PBS 缓冲液）。

1.2.5.2 siRNA 转染与CSE 刺激按每孔7.5 μL Lipofectamin 3000、75 pmol siRNA（由吉萨基因合成）及2×125 μL Opti-MEM培养基比例混合转染试剂，先分别以Opti-MEM 培养基稀释Lipofectamin 3000 试剂及siRNA 试剂，然后将稀释好的siRNA试剂缓慢滴加入稀释好的Lipofectamin 3000 试剂中，将混合好的转染试剂按实验分组加入去除双抗的细胞培养基中培养24 h，更换培养基，按实验分组给予细胞5%CSE刺激24 h，WNT5B siRNA序列正义链：3'-CCAAGACUGGCAUCAAGGAAUTT-5'，反义链：3'-AUUCCUUGAUGCCAGUCUUGGTT-5'。

1.2.6 RT-qPCR 法检测MUC5AC 及WNT 基因转录水平使用离心柱法提取细胞总RNA，稀释至20 ng/μL 后逆转录成cDNA，使用荧光定量PCR试剂盒进行qPCR 实验，反应引物如表1（由北京六合华大基因科技有限公司合成），反应体系：2 ×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，引物各1 μL，ROX reference Dye（20 μmol/L）0.04 μL，cDNA 模板5 μL，ddH2O 3 μL，总体系为20 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃高温变性5 s，58 ℃退火延伸30 s，高温变性及退火延伸40个循环。采用2-ΔΔCT算法计算并分析结果。

表1 引物列表Tab.1 Primers

1.2.7 统计学方法运用Graphpad prism9 软件进行统计分析，每组数据至少来自3 次独立重复实验，计量资料以均数±标准差来表示。两组相关样本使用配对样本t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转录组测序结果

2.1.1 送检RNA 及测序数据质检结果送检总RNA 样本完整性较高（RIN 均＞9，28S/18S 均＞2）且足量，达到建库标准。过滤后Quality ＞20的Clean reads 比率均＞97%，对比成功的Clean Reads 比例均大于93%。

2.1.2 转录组测序结果本次测序共检测出17 097个基因，其中429 个仅在Control 组表达，1 259 个仅在CSE 组表达（图1），使用Dr.Tom 软件共筛选出2 567 个差异基因（DEGs），其中上调基因1 027 个，下调基因1 540 个，DEGs 表达量聚类热图示生物学重复实验组间相似度较高，对照组与实验组有显著差异，差异基因火山图示差异基因表达倍数及差异程度（图2）。

图1 各组基因表达数量韦恩图Fig.1 The Wayne Chart of gene expression of each group

图2 差异基因表达Fig.2 The expression of differential gene

2.1.3 GO、KEGG pathway 功能注释注释结果如图3、4，注释到信号通路相关的DEGs 共有1 000 个。

图3 KEGG Pathway 分类注释柱状图Fig.3 The analysis of KEGG pathway term

2.1.4 GO_BP 及KEGG Pathway 富集分析富集结果显示信号传导相关DEGs 主要富集到以下信号通路中，见图5。

图5 GO-BP 及KEGG pathway 富集分析Fig.5 GO-BP and KEGG pathway enrich ment analysis

2.1.5 WNT 信号通路相关DEGs 进行差异分析数据显示富集到WNT 信号通路的相关DEGs 共57 个，其中23 个基因上调（表2），34 个基因下调（表3）；KDA 分析结果显示10 个KDA 基因及22个初始基因，KDA 基因中的WNT 基因包括上调基因WNT9A，下调基因WNT4、WNT5B、WNT10A，初始基因中的WNT 基因包括下调基因WNT6（图6）。

表3 下调的WNT 信号通路富集基因Tab.3 The down-regulated enrichment gene in WNT signalling pathway

图6 KDA 分析Fig.6 KDA analysis

表2 上调的WNT 信号通路富集基因Tab.2 The up-regulated enrichment gene in WNT signalling pathway

2.2 CSE刺激16HBE后WNT基因转录水平CSE组较对照组WNT4、WNT5B、WNT6、WNT10A 转录水平均下调，CSE 组WNT9A 转录水平较对照组上调，差异均有统计学意义（P＜0.001）。此结果与转录组测序结果一致（图7）。

图7 WNT 基因转录水平Fig.7 Transcription level of WNT gene

2.3 激活Wnt/β-Catenin 信号通路对16HBE 细胞MUC5AC 转录水平的影响在不给予CSE 刺激的情况下，WNT 信号通路激活组MUC5AC mRNA相对于对照组明显上调，而在给予香烟烟雾刺激的情况下，激活经典WNT 信号通路较不激活MUC5AC mRNA，无显著变化趋势（图8）。

图8 MUC5AC 转录水平变化Fig.8 Changes of transcription level of MUC5AC

2.4 敲低WNT基因对16HBE细胞MUC5AC转录水平影响敲低WNT4、WNT6、WNT9A、WNT10A基因前后对MUC5AC 转录水平的影响无统计学意义。敲低WNT5B 基因能显著提升16HBE 细胞MUC5AC 转录水平（图9）。

图9 MUC5AC 转录水平相对表达量Fig.9 Relative expression of MUC5AC transcript level

3 讨论

一直以来，吸烟都被认为与慢性阻塞性肺病黏液高分泌有关，但其机制尚不清楚。为探索参与该机制的信号通路及相关基因，本研究通过以CSE 刺激16HBE 细胞，选取使MUC5AC 转录水平最大程度上调的刺激条件（5%CSE，24 h）来培养16HBE 细胞，并提取总mRNA 进行转录组测序，经生物信息学分析发现CSE 主要引起16HBE 细胞血管生成及细胞内信号转导、MAPK 信号通路、WNT信号通路、转化生长因子β 受体负调控相关信号通路、PI3K-Akt 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、AMPK 信号通路、Rap1 信号通路等信号通路表达异常。其中TGF-β3（转化生长因子β3）已被证明通过调节气道上皮细胞自噬途径促进MUC5AC高表达［6］。PI3K/AKT 信号通路被证明参与直肠癌黏蛋白MUC2 的过度分泌［7］。AREG（双调蛋白）能通过激活HBECs 中EGFR-PI3Kα-AKT/ERK 通路来增强PM（颗粒物质）诱导的炎症和黏液高分泌［8］。在LPS 诱导的哮喘模型中，激活AMPK/SOCS1 能抑制MUC5AC 的表达［9］，Rap1 可以成为非经典WNT信号通路下游信号［10］，但它是否与MUC5AC 分泌相关目前鲜有报道。MAPK 级联反应及表皮生长因子受体（EGFR）基因的异常表达被大量实验证明在香烟烟雾诱导的气道黏液高分泌当中发挥重要作用，EGFR 及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分别能通过激活气道上皮细胞中的MAPK 级联反应及NFκB 信号通路从而在MUC5AC 基因表达和产生中起到关键作用［11-14］。然而针对以上靶点所开发黏液分泌抑制药物由于药物副作用、易耐药性等原因终止了临床实验［15］。进一步探索COPD 黏液高分泌分子机制，并寻找新的药物作用靶点仍是所需努力的方向。

图4 GO 分类注释柱状图Fig.4 The analysis of GO term

本研究观察到两种富集均提示了WNT 信号通路，且其已在慢性呼吸道疾病中得到广泛研究［16-18］。有研究表明多种WNT 及WNT 靶基因在健康吸烟者和患有COPD 的吸烟者中下调［19］，经典WNT 信号通路激动剂氯化锂可减轻实验性肺气肿［20］。而FMCA 等［21］却报道了相反的结果，他们的研究表明，与非吸烟者和吸烟对照组相比，COPD 患者WNT/β-Catenin 途径在气道上皮中上调。非经典信号通路中的WNT-5A 也被证明在COPD 患者中表达上调，且WNT-5A 干扰了经典信号通路介导的肺泡上皮细胞修复［22］，总之无论是经典或非经典WNT 信号通路均被证实在COPD 中存在异常表达，但其差异趋势及其在COPD 中的作用机制存在争议。

尽管WNT 信号通路在COPD 中被广泛研究，但其是否参与COPD 中黏液高分泌的发生鲜有文献报道。LIU 等曾报道敲低内源性经典WNT 信号通路效应蛋白β-catenin 能显著下调高渗引起的16HBE 细胞MUC5AC 蛋白的表达水平［23］。而ZHANG 等的实验表明在小鼠哮喘模型中，对Wnt信号通路负向调节因子进行抑制可明显上调MUC5AC 的表达水平［24］，这些实验提示WNT 信号通路参与调节MUC5AC 的表达，由此推测WNT 信号通路可能也参与COPD 中气道黏液高分泌的发生过程。于是将转录组测序结果中WNT 信号通路相关差异基因进行KDA 分析，结果提示表达下调的非经典WNT4、WNT5B 基因、表达下调的经典WNT6、WNT10A及上调的经典WNT9A 为KDA基因或初始基因。随后使用RT-qPCR 实验验证了这些基因的测序结果并进一步使用经典WNT信号通路激动剂及siRNA 干扰技术来验证该通路及相关基因是否参与16HBE细胞MUC5AC的上调，结果显示在无CSE刺激时，激动WNT信号通路能明显上调MUC5AC 转录水平［（3.197±0.509 4）vs.（1±0），P= 0.031 3］，而在给予CSE 刺激时，这种上调消

失。这可能是源于CSE 降低了16HBE 细胞对WNT激动剂的敏感性。另外，本研究发现在敲低WNT5B基因后，WNT5B siRNA 组+CSE 组MUC5AC mRNA较阴性对照+CSE 组上调2.092 倍［（9.066±3.442）vs.（4.333±1.121），P=0.016 2］，这表明非经典信号通路中的WNT5B 参与CSE 诱导的16HBE 细胞MUC5AC 的上调。但HELINE 等及其前期的研究证明CSE 上调COPD 患者的原代细胞的WNT5B 蛋白及16HBE 细胞WNT5B 转录水平［25］。该研究结果与本研究相反，这种差异可能源自于使用了不同的实验细胞，及不同的CSE 刺激条件，观察到Eline 在实验中使用的CSE 刺激条件为5%CSE 刺激16HBE 仅6 h。另外，笔者观察到转录组测序数据结果中提示RAP1 信号通路相关基因转录水平显著异常，推测WNT5B 可能通过非经典的WNT/RAP1 信号通路发生作用，进一步验证有助于明确具体的非经典WNT 信号通路。

本研究证明了非经典WNT信号通路的WNT5B参与人支气管上皮细胞中MUC5AC 的调节，为COPD 黏液高分泌分子机制研究提供了新的数据支持，并为寻找新的COPD 药物作用靶点提供理论依据。