紫外可见分光光度法测定化橘红中总黄酮的含量*
2022-11-09李幸穗黄淑慧郭俐麟
李幸穗，黄淑慧，郭俐麟
(广州卫生职业技术学院，广东 广州 510000)
我国中医药文化历史悠久，中医药乃中华优秀传统文化宝库中非常重要的组成部分，是中华民族的国粹。中草药是预防、治疗疾病的重要手段，中草药种类繁多、资源丰富、疗效确切，既能防治常见病、多发病，还可治疗疑难病症。近年，新冠肺炎疫情肆虐，在总结我国国内疫情防控救治工作经验的基础之上，中国积极分享防控经验，赢得了国际社会的普遍赞誉与高度评价，对中医药的走向世界起到了推动作用。
化橘红又名“化州橘红”，是较为常见的止咳化痰中药，属于广东省道地药材，出产于广东省茂名市化州市，是中国国家地理标志性产品。《本草纲目拾遗》记载化橘红可以治痰症、消油腻、谷食积、醒酒、宽中、解蟹毒，《岭南采药录》也记载化橘红味苦辛、性温平、无毒。化橘红是一种名贵中药材，具有散寒燥湿，利气消疾，止咳、健脾消食等功效，有“南方人参”之称。2006年，化橘红被列入国家地理标志产品保护，2012年，化橘红(中药文化)入选广东省非物质文化遗产项目，同年化橘红被列入《美国药典》。目前化橘红类的药材主要包括正毛橘红、副毛橘红、光橘红、光黄橘红等品种。
化橘红主要有效成分有黄酮类化合物，还含有香叶醇、芳樟醇、枸橼酸等成分，其中最主要是柚皮苷、野漆树苷和新橙皮苷等[2]。前二者含量之和占化橘红总黄酮类总量的84%以上，因此，在现有的质量控制标准中常常把柚皮苷或野漆树苷作为化橘红的关键质量控制指标。实验室条件下提取化橘红黄酮类化合物主要有索氏回流提取法[3]、超声波法[4]和酶解辅助法[5]等，目前总黄酮含量测定方法有UV、TLC、HPLC、HPLC/MS等方法[6]。为准确测定化橘红中总黄酮的含量以及最佳提取工艺，本文选取水浴回流加热提取法进行研究，采取紫外可见分光光度法测定样品中总黄酮的含量，简便快捷，适用于化橘红产品的提取和质量控制，为化橘红制剂开发提供有效依据。
1 设备与实验材料
1.1 主要设备
752N紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；KQ-250DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HH-S2数显恒温水浴箱，金坛市医疗仪器厂；DHG-9203A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；4500A多功能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司；BS224S万分之一天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
1.2 实验材料
化橘红，化州市礞石山橘红发展有限公司；柚皮苷对照品(批号：110722-201815，含量91.7%)，中国食品药品检定研究院；甲醇(分析纯)，天津市百世化工有限公司；无水乙醇(分析纯)，天津市百世化工有限公司。
2 实验方法
2.1 对照品溶液的配制
取柚皮苷对照品8.0 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加无水乙醇适量使溶解，并加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 mL含柚皮苷80 μg的对照品溶液。
2.2 供试品溶液的配制
将化橘红去除杂质，置80 ℃烘箱干燥4 h至恒重，粉碎，过60目筛，取橘红粉末适量(约0.5 g)，精密称定，置圆底烧瓶中，精密量取无水乙醇50 mL，称定重量，置水浴中加热回流70 min，室温放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液0.125 mL，置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，摇匀，即得。
2.3 测定波长选择的方法
以50%乙醇为空白，在200～400 nm 范围内，分别对对照品溶液与供试品溶液进行光谱扫描，选择最大吸收波长作为测定波长。
2.4 标准曲线的制备
精密量取2.1项下对照品溶液1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL于10 mL量瓶中，用50%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品系列溶液。以50%乙醇为空白，在283 nm处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2.5 精密度实验
精密量取2.1项下对照品溶液2.5于10 mL量瓶中，用50%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀后连续测定6次，计算结果。
2.6 稳定性实验
取2.2项下供试品溶液，在放置0、10、30、60、90、120 min后，按照“2.4”项下方法在283 nm处分别测定吸光度，计算结果。
2.7 重复性实验
取2.2项下供试品溶液，每份约 0.5 g，精密称定，按照2.2项下供试品溶液制备方法平行制备5份样品，按照“2.4”项下方法在283 nm处分别测定吸光度，计算测定结果。
2.8 加样回收率实验
按照高、中、低3个质量浓度梯度，精密称取已测含量的化橘红粗粉(已知总黄酮含量为15.92%)样品9份，精密加入一定量柚皮苷对照品溶液，至烧瓶中，按照“2.2”项下制备样品，按拟定方法测定A值，计算加样回收率。
3 结 果
3.1 最佳吸收波长的选择
通过光谱扫描图发现，两者光谱图基本一致，且在283 nm(±1 nm)处有最大吸收，因此，选取最大吸收283 nm作为测定总黄酮的测定波长。
3.2 线性关系考察结果
按2.4方法进行考察，标曲曲线测定结果为，回归方程：A=0.0252C-0.0103，相关系数r=0.9999(A为吸收度；C为浓度，μg·mL-1)，实验结果表明，该方法测定化橘红中总黄酮含量在12～28 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。
3.3 精密度考察结果
按2.5方法进行精密度考察，测得对照品溶液平均浓度为20.11 μg/mL，RSD为0.1%，表明该方法测定结果的精密度良好。
3.4 稳定性考察结果
按2.6方法进行稳定性考察，化橘红中总黄酮含量平均值为15.96%，RSD为1.1%，结果表明，该方法测定供试品溶液在2 h内稳定性良好。
3.5 重复性考察结果
按2.7方法进行重复性考察，化橘红中总黄酮含量平均值为15.89%，RSD为1.5%，结果表明，该方法测定化橘红中总黄酮含量的重现性良好。
3.6 加样回收率考察结果
按2.8方法进行加样回收率考察，结果表明，平均回收率为100.8%，其RSD为1.7%(回收率=测得量-药材×含量%/对照品加入量×100%)。
表1 加样回收率试验(n=9)Table 1 Sample recovery test(n=9)
3.7 化橘红中总黄酮含量测定
按照2.2项下试供品溶液制备方法制备样品三份，再按照“2.4”项下方法在283 nm处测定吸光度，计算试供品溶液浓度C，然后按下式计算总黄酮含量。测定化橘红中总黄酮平均含量为15.92%。
提取率=C×D(稀释倍数)×V(提取体积)/原材料质量×100%
总黄酮含量=C×D(稀释倍数)×V(提取体积)
4 讨 论
根据陈永刚等[8]、彭颖等[9]、王雯等[10]、韦英杰[11]和庞瑞等[12]的研究结果，总黄酮得率差异性很大，究其原因，可能是所用化橘红品种不同[13]，以及提取方法有差异等有关。化橘红中黄酮类化合物的提取方法有很多，包括回流提取法、超声波提取法等，回流提取法使用较多，它利用了黄酮类化合物在有机溶剂中溶解度较大的原理，将黄酮类化合物直接从化橘红中萃取出来。根据黄酮类化合物及其杂质的极性大小不同，选取适宜的有机溶剂，如甲醇、乙醇、乙醚、石油醚等。
超声波提取法[3]利用了超声波的空化效应、扰动效应、击碎效应，热力效应等与传统溶剂萃取法相结合的原理，连续产生的高压不断地冲击细胞壁，使之破裂，从而使内容物释放至提取溶剂中，物质交换次数随碰撞次数不断增多，使得细胞膜透过能力也得以增强，从而使得黄酮类化合物溶解进入到溶剂的速度增加，此外，化合物在试剂中溶解性的增强可提高其提取率，缩短提取时间。此法操作简便方便，所需时间相对较少，提取率较高。本研究在进行化橘红最佳提取工艺(试供品溶液制备)确定时，采用均匀设计，选用超声提取法及水浴加热回流提取法进行对比，采用100%乙醇在45 ℃超声提取提取60 min得出的提取率为10.90%；85%乙醇水浴加热回流提取50 min得出的提取率为11.05%，100%乙醇水浴加热回流提取70 min得出的提取率为15.92%，以此确定提取溶剂为100%乙醇，提取方法为加热回流提取法。
黄酮类化合物检测方法较多，包括单一的分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法等。在实际工作中，薄层色谱法适用于药物的定性分析，也曾经用于化橘红中黄酮单体含量的定量分析，但现在大多被高效液相色谱法所代替，目前该法主要适用于化橘红的品种鉴定。高效液相色谱法常用于黄酮单体含量的测定，如化橘红中柚皮苷的含量测定等。高效液相色谱-质谱联用法是最新的检测技术，不仅可用于化橘红中黄酮类化合物的定性及定量分析，还可以提供黄酮类化学物丰富的结构信息，具有非常强大的组分鉴定及检测能力，分析检测成本较高。紫外可见分光光度法常用于药物的定性与定量检测中，具有专属性较强，操作简单快捷的特点，可用于总黄酮的测定，是总化合物测定方法的首选方法。化橘红中的总黄酮主要以柚皮苷的形式存在，其含有多个酚羟基，受光照射或暴露在空气中，容易变色，采用紫外分光光度法测定化橘红中总黄酮含量可以避免检测结果不准确的现象，且该测定方法操作简单方便[7,14-16]，在测定化橘红类产品时能发挥很好的作用。
5 结 论
本研究以化橘红为原料，采用均匀设计优化了化橘红中总黄酮的提取工艺，选择了提取溶剂、提取体积、提取时间进行考察，最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数100%，液料比1:100，提取时间70 min，采用水浴加热回流提取法。在此条件下，黄酮的平均提取率为15.92%。该提取方式适用于大多数实验室条件，不用石油醚进行提取化橘红总黄酮的最佳提取工艺。将化橘红提取液浓缩后可用于制备化橘红颗粒、化橘红泡腾片等，为化橘红的资源利用提供了参考。
