玉米醇溶蛋白/阿维菌素纳米制剂的制备与性能*

陈树茂，李梓泳，何培浩，周红军，周新华

(1 深圳诺普信农化股份有限公司，广东 深圳 518102；2 仲恺农业工程学院化学化工学院，广东省普通高校农用绿色精细化学品重点实验室，广东 广州 510225)

随着全球人口增加、气候变化、害虫和病害爆发，对粮食的需求量大大增加，农用化学品的用量上升[1]。大量的使用农用化学品对环境造成很大的污染，一方面，因为农药制剂本身的性质直接导致的环境污染和在使用过程中未作用到目标上而流失到环境中而造成污染；另一方面，农民未经专业培训，常常在使用时加大使用剂量，造成大量农药流失。因此有必要对制剂的性能进行提升，以减少环境的污染和提高作物的产量。目前，随着国家环保政策和农药管理制度的不断完善，农药剂型向着绿色水剂化方向发展[2]。

玉米醇溶蛋白是玉米的主要贮藏蛋白，因为其特别的氨基酸组成，玉米醇溶蛋白能溶解于乙醇与水的混合溶液，但不溶于水和100%的乙醇[3]。其疏水特性能够很好地封装疏水性的农药活性组分。蛋白质自身富含二硫键，因此可以在昆虫的消化系统中分解，从而释放载体包封的药物，起到刺激响应的作用[4]。

在本工作中，利用玉米醇溶蛋白的疏水特性对阿维菌素进行包封。探究不同混合溶剂与水的比例、不同玉米醇溶蛋白质量、不同乙醇浓度对玉米醇溶蛋白粒子粒径的影响。使用扫描电镜对其形貌进行观察分析；对粒子在黄瓜叶面上的接触角和叶面滞留量等进行探究，研究了AVM@Zein粒子的抗紫外线性能、缓释性能及杀虫活性。

1 实 验

1.1 主要试剂

玉米醇溶蛋白(Zein)、还原型谷胱甘肽(分析纯)、胰蛋白酶(猪胰脏)，上海麦克林生化科技有限公司；阿维菌素(AVM，工业级，纯度为95%)，河北威远生物化工有限公司；无水乙醇(分析纯)，天津大茂化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

激光粒度仪(90 Plus型)，英国马尔文仪器有限公司；分析天平(SQP型)，上海精科天美科学仪器有限公司；接触角仪(Theat型)，瑞士百欧林仪器公司；高效液相色谱仪(1200 S型)，安捷伦科技有限公司。

1.3 AVM@Zein的制备

把0.1 g的Zein和0.01 g阿维菌素溶解在10 mL 70%乙醇溶液，迅速倒入水中，搅拌30 min后转至烧瓶中，40 ℃旋转蒸发，经过上述的反溶剂法即可制备载药粒子(AVM@Zein)。制备过程如图1所示。

图1 制备示意图Fig.1 Schematic diagram of preparation

1.4 结构表征及性能测试

1.4.1 动态光散射粒度测试

取稀释后的样品溶液于塑料比色皿中，稳定2 min后，测定样品的动态光散射粒径，重复测试3遍。

1.4.2 扫描电镜(SEM)

将样品溶液稀释后取1滴在导电胶上，在室温下干燥，喷金后在加速电压为15 kV下获得样品形貌图。

1.4.3 载药性能

称取10 mg冷冻干燥后的载药粒子置于离心管后加入5 mL乙醇，以洗涤载药颗粒外表面的阿维菌素，12000 rpm离心5 min。取1 mL上清液于10 mL棕色容量瓶中，并用无水乙醇定容。用高效液相在245 nm下测阿维菌素的浓度，根据公式(1)计算出阿维菌素的包封率(EE)，其中mtotalAVM为体系AVM总质量(mg)，mfreeAVM为体系中未包封的阿维菌素质量(mg)。

EE=(mtotalAVM-mfreeAVM)/mtotalAVM

(1)

1.4.4 抗紫外性能

把10 mL新鲜制备的载药悬浮液分散于90 mL水溶液中，在距离20 cm的紫外光源(300 W, Emax=365 nm)的照射下，进行抗紫外性能试验。然后每隔一段时间取出一部分溶液，并用高效液相色谱进行浓度测定，流动相为乙腈:水=1:9(V/V)。由公式(2)可得残留率(Rv)，其中A0为AVM在溶液中的初始浓度(mg/L)，Ai为不同光照时间后样品中的AVM浓度(mg/L)。

(2)

1.4.5 接触角和叶面滞留量测试

配制2 mg/mL的样品溶液和AVM溶液，采用光学接触角仪测量在黄瓜叶片上的接触角。黄瓜叶片采摘后用去离子水冲洗干净，放置于干净的玻片上晾干。用微量进样器将不同样品的溶液滴到叶子表面，记录接触角，每种样品在叶片不同部位进行3次重复操作。

将冲洗后晾干的包菜和黄瓜叶片裁成2.5 cm×2.5 cm，浸泡在样品溶液15 s后，用镊子垂直提起至无液滴落下，放置于分析天平上称重。滞留量(LHC)公式如下：

(3)

其中M0和M1分别表示浸泡前后叶片的重量(mg)，S表示叶片的面积(cm2)。

1.4.5AVM缓释试验

将新鲜制备的载药粒子悬浮液(5 mL)放入含有1 mg/mL谷胱甘肽(1 mL)的透析袋中，作为氧化还原缓释刺激响应组，用绳子绑紧后置于锥形瓶中，然后在室温下加入40%乙醇水溶液(50 mL)进行缓释。同时将1 mg/mL谷胱甘肽(1 mL)换成相同浓度胰蛋白酶(1 mL)和水(1 mL)，作为酶刺激响应组和空白对照组。在一定的时间间隔，取1 mL样品于棕色容量瓶后，用高效液相色谱仪测定样品溶液的AVM浓度，并及时加入1 mL相应的乙醇水溶液至锥形瓶。根据标准曲线：A=8042.8129C-635.125(R2=0.996)计算AVM浓度。累积释放率(Ri)按照式(4)计算，Ci为每个样品在不同时间间隔时AVM的质量浓度(mg/L)，mAVM为锥形瓶中AVM的总质量(mg)。

(4)

1.4.6 杀虫活性

将上海青叶子(大小：2.5×2.5 cm2)浸泡在浓度为100、50、25、12.5、6.25和3.125 mg/L的载药粒子溶液里，待其自然干燥后，与10头2龄的小菜蛾一同放入垫有滤纸的培养皿中，于恒温室中培养48 h后观察其死亡情况，刺激时不能移动则视为死亡。用AVM乙醇溶液处理昆虫作为对照组，并计算死亡率和校正死亡率。

2 结果与讨论

通过调整Zein在混合溶剂的溶解度来探究对AVM@Zein粒径的影响，控制其自组装成纳米粒子。调整二元混合溶液中乙醇含量与水相体积比、Zein质量、二元混合溶液中乙醇含量等条件来优化制备参数。

2.1 二元混合溶液与水相体积比对粒径的影响

表1 AVM@Zein在二元混合溶液与水相不同体积比下的粒径变化Table 1 Particle size change of AVM@Zein under different volume ratio of binary mixed solution and aqueous phase

将100 mg的Zein和10 mg AVM溶解于10 mL 70%的乙醇溶液里，探究改变水相的体积(25、50、75、100 mL)对粒径的影响。由表1可知，提高水相的比例可减小粒子的粒径，但粒子的多分散指数也升高，在旋转蒸发后水相占比高的粒子发生沉淀，可能是旋转蒸发加热时，粒径分布宽的粒子中的Zein链段展开，溶液中的大粒子较多容易发生聚沉[5]。

2.2 Zein质量对粒径的影响

上述单因素试验中，二元混合溶液:水相的比例(体积比)为10:75条件下制备的粒子粒径最小。故将不同质量(100、400、700、1000 mg)的Zein和10 mg AVM溶解于10 mL 70%的乙醇溶液里，倒入75 mL的水相中。探究不同质量Zein对粒径的影响。随着Zein浓度的增加，原液的黏度上升，影响分散液滴的扩散速率，Zein在溶液的形成“核”后有较长的时间可以使粒子不断长大，导致较大的液滴和更大的粒子。相对来说，较低浓度的Zein扩散速率快，成核和生长的时间较短，生成更小的颗粒[6]。

表2 AVM@Zein在不同Zein质量下的粒径变化Table 2 Particle size variation of AVM@Zein under different Zein mass

2.3 二元混合溶液中乙醇含量对粒径的影响

上述单因素试验中，用质量为100 mg的Zein制备的粒子粒径最小。故将100 mg的Zein和10 mg AVM溶解于10 mL不同浓度的乙醇溶液(70%、75%、80%、85%、90%)里，倒入75 mL的水相中。探究二元混合溶液中乙醇含量对粒径的影响。随着乙醇浓度的增加，乙醇浓度从70%增加到90%，纳米粒子粒径从83.72 nm增大到140.92 nm，由于不同溶剂的极性不同，Zein的氨基酸残基发生重排，当疏水链段暴露在聚集体表面时，Zein分子之间的疏水作用使粒子发生不同程度的团聚导致粒径变大[7]。

表3 AVM@Zein在二元混合溶液中不同乙醇含量下的粒径变化Table 3 Changes in particle size of AVM@Zein with different ethanol contents in binary mixed solution

2.4 最小粒径的AVM@Zein的包封率

表4 最小粒径的AVM@Zein的包封率Table 4 Encapsulation efficiency of AVM@Zein with smallest particle size

从上述的单因素试验可知，100 mg的Zein和10 mg AVM溶解于10 mL 70%的乙醇溶液条件下制备的粒子粒径最小，故以此为最优样品进行包封率及其他试验表征。如表4所示，AVM@Zein的包封率为48.45%。

2.5 纳米粒子形貌

图2为Zein粒子的扫描电镜图，AVM@Zein为较为规则的球状颗粒。Zein的蛋白质链段在70%乙醇溶液中为舒展状态，倒入水后溶剂极性增加，蛋白质链段发生卷曲，形成较为规则的纳米球体，在制样的干燥过程中，粒子外部的氨基酸链段因疏水作用使部分粒子之间发生黏连。

图2 AVM@Zein的SEM图Fig.2 SEM image of AVM@Zein

2.6 缓释性能分析

Zein粒子在不同条件下释放AVM的曲线如图4所示。不外加酶的Zein粒子(图中图例为CK)在前10 h释放速率较快，累积缓释率为27%，在这之后释放速率变慢，在96 h时的累积缓释率在59%左右。加了胰蛋白酶的Zein粒子在前10 h释放与CK的差别不大，随后的阶段，释放速率相对较快，因为胰蛋白酶能分解Zein。但在此处的分解速率没有Monteiro等[8]报道的大，可能是缓释的介质不一样，胰蛋白酶在40%的乙醇溶液里活性不高[9]。缓释介质中加了谷胱甘肽来模拟氧化还原刺激响应，此时Zein粒子释放AVM的速率最快，因为谷胱甘肽可以破坏连接蛋白质链段的二硫键[10]，使Zein粒子破裂，最终在15 h时到达一个“平台期”，Zein粒子具有明显的氧化还原刺激响应。

图3 AVM在不同条件下的释放曲线图Fig.3 Release curves of AVM under different conditions

2.7 抗紫外性能

AVM在紫外线照射下容易分解，原药在5 min内残留率就降到50%以下，持续照射140 min后残留率仅2%。商业乳油比AVM原药的抗紫外线性能好，可能是表面活性剂胶束对紫外线的阻隔和特殊紫外线保护助剂的加入，最终的残留率有14%。沾在Zein粒子外部的AVM容易分解，故AVM残留率曲线斜率在10 min内比较大。Zein在紫外线的照射下会将疏水基团暴露在溶液中，产生的疏水作用力会引起聚集，增加物理屏障作用；同时粒子内部发生重组，导致结构更加紧密[11]，使AVM的释放更慢，所以残留率曲线10 min后变得平缓。最终残留率23%，比商业乳液高，能较好地防止AVM的降解。

图4 AVM@Zein中AVM的光降解曲线Fig.4 Photodegradation curve of AVM in AVM@Zein

2.8 叶面润湿性能

水、商业乳油、Zein粒子水分散液在黄瓜上的接触角如图5所示，水在黄瓜叶片上的接触角为(92.64±1.64)°，商业乳油和Zein粒子水分散液的接触角分别为(61.63±0.32)°和(81.50±0.83)°。液滴接触角越小越容易在植物叶面分布，商业乳油在黄瓜叶面的接触角较小，因为其中含有浓度较高的油脂和特殊润湿剂，与叶面有较好的亲和性。Zein粒子水分散液的接触角介于水和商业乳油之间，也有一定的铺展作用。

图5 AVM@Zein的接触角图Fig.5 Contact angle of AVM@Zein

图6 水、商业乳油、AVM@Zein粒子在黄瓜叶和包菜面的 滞留量Fig.6 Retention of water, commercial EC, and AVM@Zein particles in cucumber leaves and cabbage noodles

农药喷施后在叶面滞留的药量对其利用率影响很大。水、商业乳油和AVM@Zein在黄瓜叶面和包菜叶面滞留情况如图6所示。水在黄瓜叶面和包菜叶面的滞留量相差不大，商业乳油在润湿剂的作用下能较好地润湿叶面，故其滞留量比水大。包菜叶面属于疏水叶面，而黄瓜叶属于弱亲水叶面，且黄瓜叶面存在的绒毛起到阻碍液滴滑落的作用，所以在黄瓜叶面上的滞留量更大[12]。AVM@Zein的疏水基团较多与叶面的蜡质层等有疏水作用力，能滞留更多的药物在叶面上，说明AVM@Zein比商业乳油的滞留性能好。

2.9 杀虫活性

不同样品的毒力活性如表5所示，原药、商业乳油和AVM@Zein的半致死浓度分别为3.39、0.12、0.66 mg/L。商业乳油和AVM@Zein表现出更好的杀虫活性，阿维菌素既有胃毒作用又有触杀作用，因为这两者在叶面的润湿性好使AVM与小菜蛾接触的比表面积大。AVM@Zein被害虫摄入后，蛋白链段之间的二硫键被体内的谷胱甘肽分解，释放药物，达到更好的杀虫效果[13]。

表5 毒力测试结果Table 5 Virulence test results

3 结 论

通过反溶剂法制备Zein负载阿维菌素纳米粒子，通过混合溶剂与水不同的体积比、不同Zein质量、不同乙醇浓度的单因素试验，得出最小载药粒子的动态光散射粒径为83.72 nm； AVM@Zein对AVM有保护作用，经过140 min紫外线照射后残留率为23%比未包封的AVM高10倍； AVM的释放具有氧化还原和酶刺激响应性；AVM@Zein的杀虫活性明显高于原药。