细菌内毒素光度法检测能力验证研究

杜 颖，陈 晨，蔡 彤，谭德讲，高 华

(中国食品药品检定研究院化学药品检定所药理室，北京 102629)

细菌内毒素是一种能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。注射用药品中如果含有被污染的外源性内毒素，在临床使用时，病人会出现发热反应，严重时还会出现寒颤、恶心、甚至死亡等热原反应。20世纪70年代，建立了使用鲎试剂检测注射液中的细菌内毒素的检查法——细菌内毒素检查法。目前《中国药典》2015年版中共有653个品种采用此方法检验，可见细菌内毒素检查法是保证临床用药安全的重要手段之一，也是药品常规检测中的一项关键安全性指标。

实验室能力验证是通过实验室间检测结果的比对来确定实验室能力的活动，包含能力验证计划、实验室间比对计划和测量审核等所有与能力验证相关的活动。它是评价实验室技术能力的重要技术方法之一，是判断和监控实验室能力的有效手段，也是实验室内部质量控制方法的有效补充。同时，能力验证也是维持认可机构间国际互认的基础之一[1-2]。

细菌内毒素检查法的原理和操作[3]虽然简单，但是有很多因素会影响实验结果，如鲎试剂灵敏度、实验环境、实验人员的操作等。为考察全国药检系统实验室细菌内毒素检测能力的基本情况，2020年中国食品药品检定研究院(NationalInstitutesforFoodandDrugControl,NIFDC)按照实验室认可和实验室资质认可的有关要求，组织实施了细菌内毒素光度法检测能力验证计划[4]，编号为NIFDC-PT-267。希望通过此次能力验证这一外部质控手段，在全国范围内评价实验室细菌内毒素光度法检测能力，并推动内毒素检测能力和技术水平的进一步提高。

本文概述了能力验证项目NIFDC-PT-267的实施情况，对检测数据进行了技术分析，以帮助各实验室对自身的细菌内毒素检测能力有更全面的认识并改善提高，同时也为管理部门利用实验室资源提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 待测样品制备本次能力验证待测样品为细菌内毒素白色冻干粉末，2 mL玻璃安瓿装。每个参加实验室发放1支待测样品。

1.2 待测样品均匀性和稳定性考察随机抽取能力验证待测样品20支，按照CNAS-GL003：2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[5]规定，采用《中国药典》2015年版四部通则1143细菌内毒素检查法中的光度测定法对样品进行检测。采用单因素方差分析检验样品的均匀性，结果P>0.05。表明本次能力验证待测样品支间差异无统计学意义，均匀性良好。

细菌内毒素具有良好的稳定性，根据多批细菌内毒素标准品的检测数据可以得出，稳定期均在5年以上。

1.3 待测样品检测方法与结果统计

1.3.1检测方法 本次能力验证计划要求实验室按照《中国药典》2015年版四部(通则1143)细菌内毒素检查法[3]-方法2 光度测定法中的任意一种方法进行检测。

1.3.2结果统计方法 本计划参照CNAS-GL002：2018《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》[6]及ISO 13528[7]，采用参加者的公议值，即本次所有参加实验室的有效检测结果的稳健平均值作为该轮次能力验证待测样品内毒素含量的指定值X。统计分析使用统计软件JMP13，进行稳健均值及稳健标准差的计算，该计算是使用Huber M估计以不受离群值影响的方式计算的稳健均值。

因影响细菌内毒素检测结果准确性的因素有很多，如溶解、稀释、加样过程中的容量误差和操作误差、使用仪器的仪器偏差等。《中国药典》通则1143中规定，光度检测法中检测结果回收率在50%～200%之间即为符合要求，该规定的误差范围已考虑涵盖各种因素导致的误差范围。因此本次能力验证对检测结果×的判定，以样品指定值X的50%～200%范围为判定标准。

1.3.3统计量的能力评定 将检测结果取对数(由于生物测定的数据理论上是其对数值呈正态分布，故本次能力验证先需对检测结果取对数(lg)后，再对数值进行统计分析)，而后将数值用统计软件JMP13处理分析，所得稳健均值为1.076 214 3，取反对数后数值为11 918.3 EU·L-1，即1.2×104EU·L-1。故使用1.2×104EU·L-1作为本次能力验证样品内毒素含量指定值X，应该在其的50%～200%的范围内，即6.0×103EU·L-1～2.4×104EU·L-1。

1.3.4结果判定原则 当(6.0×103EU·L-1≤x≤2.4×104EU·L-1)时，结果为“满意”；当(x<6.0×103EU·L-1或x>2.4×104EU·L-1)时，结果为“不满意”。

2 实验室参加情况

本次能力验证共有51家实验室报名参加，其中代码为417和718的实验室，在收到待测样品后提出退出。本次能力验证发放样品51份，收到49个有效数据。参加实验室分布于全国22个省(自治区)、直辖市，主要包括药品化妆品医疗器械(两品一械)检验检测系统实验室、企业QC实验室和其他实验室。其中江苏省11家实验室，广东省5家实验室，浙江省和北京市各4家实验室，山东省3家实验室，甘肃省、河南省、吉林省、四川省和上海市各2家实验室，安徽省、福建省、海南省、河北省、黑龙江省、江西省、辽宁省、山西省、陕西省、新疆维吾尔自治区、天津市和重庆市各1家实验室。

3 结果

3.1 能力验证总体统计量本次能力验证检测方法为光度测定法，将49个数据按作业指导书规定先取2位有效数字后，再取对数进行统计分析，结果汇总统计量见Tab 1。

Tab 1 Summary for statistics of test result

3.2 实验室内毒素含量检测结果及评定参加实验室检测结果及评定见Tab 2。

Tab 2 Test result and evaluation of laboratories

在49家参加实验室中，被评定为“满意”的共有45家，满意比率为91.8%；被评定为“不满意”的实验室有4家(实验室代码分别为274，604，715和915)，不满意比率为8.2%。

3.3 参加实验室检测结果分布图见Fig 1。

4 讨论[8-9]

4.1 不同实验室类型的比较参加本次能力验证的49家实验室中，两品一械检验检测系统实验室34家，占总参加实验室的70%，主要是各省、市及地方的食品药品检定机构。其中32家结果为满意，2家结果为不满意；企业QC实验室9家，占总参加实验室的18%，结果全部为满意；其他实验室6家，占总参加实验室的12%，其中4家结果为满意，2家结果为不满意。见Tab 3。

本次能力验证，与2017年细菌内毒素能力验证参加实验室数量相比较，虽然总实验室数量下降了64%(2018年参加实验室共136家，其中凝胶法113家，定量法23家)，但定量法实验室数量却增加了53%。表明随着实验技术的发展与提升，国内实验室已逐步提升自身的检测水平，在日常检测样品时，除了使用操作方便、快捷，成本低的凝胶法以外，也开始使用可以定量，且准确性高的定量法。此外，采用定量法检测的实验室，多数还是两品一械检验检测系统实验室，在企业及其他实验室使用则较少。

4.2 检测方法的选择[10-12]细菌内毒素光度测定法分为浊度法和显色基质法。根据检测原理不同，浊度法和显色基质法还可分为动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法。本次能力验证49个参加实验室，有36家使用的是浊度法(全部是动态浊度法)，占总数的73.5%；13家使用显色法(12家是动态显色法，1家是终点显色法)，占总数的26.5%。浊度法检测的数据中，35家实验室为“满意”结果，1家实验室为“不满意”结果。显色法检测的数据中，10家实验室为“满意”结果，3家为“不满意”结果。

对浊度法(36家)和显色基质法(13家)检测数据进行比较分析。首先进行异常值检测，统计结果显示，实验室代码为274、604、715和915,4个检测结果为异常值，见Fig 2。剔除该4个异常值后，将二者检测结果再进行单因素方差分析，统计结果为差异无显著性(P>0.05)，表明两种检测方法的检测结果差异无显著性。

4.3 不满意结果实验室分析[10-11]本次能力验证有4家实验室的检测结果被评为“不满意”，对这4家实验室的检测结果进行分析：(1)代码274：是本次能力验证中唯一一家使用终点显色法的实验室。其标准溶液的浓度选择为1 000、500、250和100 EU·L-14个点，所对应的吸光度值分别为1.586、1.051、0.742、0.412。其能力验证样品采用的是2倍稀释液，所得吸光度值为3.032，该值已经高于标准曲线最高浓度点的吸光度值。表明样品内毒素含量未落在标准曲线范围内，故使用该标准曲线外推法计算出来的数值，是不准确的。从而导致该实验室提供的检测结果4.2×103EU·L-1低于本次能力验证的判定下限(<6.0×103EU·L-1)，因此，评定其为“不满意”；建议实验室应调整样品稀释倍数或者标准曲线范围，使样品吸光度值落在标准曲线范围内，以保证检测结果的准确可靠。(2)代码为604、715和915：此3家实验室提供的《细菌内毒素光度法检测实验结果记录》中，实验操作符合《中国药典》通则1143中的规定，但其检测的结果未在本次能力验证指定值X的50%～200%范围内，故评定为“不满意”。建议实验室查找内部原因，以保证日后样品检测结果的准确可靠。

Tab 3 Evaluation of laboratory type and test results

Fig 1 Diagram of proficiency testing results of photometric method of bacterial endotoxin test

Fig 2 Outlier detection for test results

4.4 本次能力验证发现的问题及建议

4.4.1未在检验样品时制备标准曲线[13-15]《中国药典》通则1143中明确规定，光度检查法需按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测，使用系列溶液C(用于制备标准曲线的标准内毒素溶液)生成的标准曲线来计算溶液A(稀释倍数不超过MVD的供试品溶液)的每一个平行管的内毒素浓度。即检测样品时，要同时制备一条不少于3个浓度点的标准曲线，用该标准曲线来计算所测样品的内毒素含量。

本次能力验证中，有个别实验室在检测能力验证样品时，仅做了阴性对照、样品溶液和样品阳性对照溶液，而标准曲线则是使用保存在软件中的一条标准曲线来计算样品内毒素含量。由于光度测定法测定的灵敏性高，与凝胶法相比，检测结果的准确性更易受到实验环境、操作、仪器等因素的影响，故为避免系统误差，标准曲线和样品应在相同的实验条件下一起进行制备和检测。因此，建议实验室应按照《中国药典》通则1143中的规定，在每次实验时均需要制备细菌内毒素标准曲线，才能保证样品检测结果的准确性和可靠性。

4.4.2未做标准曲线可靠性验证[14]《中国药典》通则1143中明确规定：当使用新批号的鲎试剂或试验室条件有任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。可见，标准曲线可靠性验证是保证实验室检测结果准确可靠的前提条件。

本次能力验证中，有个别实验室未做标准曲线可靠性验证。因此，建议实验室在使用新批号的鲎试剂或试验室条件有任何可能会影响检验结果的改变时，应按《中国药典》通则1143要求先进行标准曲线可靠性验证实验，实验符合要求后，再使用该批鲎试剂进行样品的内毒素检测。

4.4.3样品反应时间未落到标准曲线上时的情况处理 在本次能力验证中，发现有个别实验室检测样品的反应时间或吸光度值落在标准曲线外(样品反应时间大于标准曲线最低浓度点反应时间和样品反应时间小于标准曲线最高浓度点反应时间)，实验室的检测结果为仪器软件使用标准曲线外推法计算出来的数值，不够精确。

《中国药典》通则1143中，虽未明确规定样品检测反应时间大于或小于标准曲线最低或最高浓度点时，样品内毒素含量应如何计算。但从科学角度出发，当样品反应时间未落在标准曲线范围内时，结果应按如下方式表示：(1)当样品反应时间小于标准曲线最高浓度点的反应时间或样品的吸光度大于最高浓度点的吸光度时，内毒素含量应为样品稀释倍数乘以标准曲线最高浓度点所得的数值，结果表述为样品内毒素含量大于XX EU·L-1；(2)当样品反应时间大于标准曲线最低浓度点反应时间或样品的吸光度小于最低点的吸光度时，表明样品内毒素含量低于标准曲线最低浓度点，其内毒素含量应为样品稀释倍数乘以标准曲线最低浓度点所得的数值，结果为样品内毒素含量小于XX EU·L-1。

若希望准确测得样品中的内毒素含量，应调整样品稀释倍数或标准曲线浓度范围，重新检测，使样品的反应时间或吸光度值落在标准曲线范围内。这样操作，所检测的实验结果，才会更加准确与可靠。