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改性桔皮膳食纤维吸附茶多酚的条件优化及其体外模拟消化稳定性研究

2022-11-09高慧颖赖恭梯官雪芳郑亚凤李舒婷王琦

南方农业学报 2022年8期
关键词:复合物茶多酚改性

高慧颖,赖恭梯,官雪芳,郑亚凤,李舒婷,王琦*

(1福建省农业科学院农业工程技术研究所,福建福州 350003;2福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002)

0 引言

【研究意义】茶多酚(Tea polyphenols,TP)是茶叶所含有的重要活性成分,具有清除机体内自由基、延缓机体衰老、预防心血管疾病、防癌等生物活性功能(Khan et al.,2017)。近年来,研究发现茶多酚可经消化道达到结肠,并通过调节人体肠道菌群结构与功效,从而保护肠道健康及用于防治以代谢综合征为代表的各类慢性疾病(Hong et al.,2021;Li et al.,2021)。然而,茶多酚在经过人体胃肠道消化环境时易被破坏、降解或代谢,造成其生物利用率低。因此,进行提高茶多酚稳定性的研究,对于茶多酚在结肠功能性食品(Colonic functional food)上的应用具有重要意义。【前人研究进展】近年来,利用天然大分子与茶多酚吸附结合形成复合物以提高茶多酚的生物稳定性已成为功能性食品研发的热点之一。吴培龙等(2010)通过酶水解方法制备玉米多孔淀粉,测得其对茶多酚的吸附性能较原淀粉提高2.1倍,有利于茶多酚的缓慢释放。Wu等(2011)研究表明,燕麦β-葡聚糖通过氢键作用在溶液中与茶多酚结合形成复合物,并显著改变其体内和体外的抗氧化活性。不被人体所消化的膳食纤维与茶多酚结合后,不仅可减少茶多酚在人体消化道内受到破坏,实现对多酚的结肠靶向运输(Tang et al.,2020),还能在肠道微生物的分解作用下将携带的茶多酚释放出来,共同被肠道微生物吸收利用(Padayachee et al.,2012;González-Aguilar et al.,2017;Maurer et al.,2019)。然而,天然膳食纤维粒径大且口感粗糙,不利于直接作为茶多酚的吸附载体应用于功能性食品开发。改性处理是提高膳食纤维理化性质和生理功能的关键技术手段,通过改性让纤维中的糖苷键断裂,可减小膳食纤维的粒径,提高其吸附能力,并减少对食品品质的不利影响(杨明华等,2016)。膳食纤维的改性方法包括物理法(Liu et al.,2016)、化学法(Feng et al.,2017)和生物法(Wen et al.,2017)。其中,动态高压微射流技术(Dynamic high pressure microfluidization,DHPM)是一项新兴的物理改性方法,在强烈剪切、高速撞击、压力瞬时释放、高频振荡、膨爆和气穴等作用力下,对膳食纤维起到显著的超微化改性作用(Wan et al.,2007)。经DHPM处理后,膳食纤维中粒度显著降低,对食品中蛋白质、油脂和多酚等物质的吸附能力提高,复合物稳定性增强。同时,纤维粒径大小与多酚的稳定性和生物利用度密切相关,纤维粒径越小对多酚的吸附和保护作用越强(Zhao et al.,2018)。【本研究切入点】目前研究大多集中在茶多酚与天然大分子之间的相互作用,而对于改性膳食纤维与茶多酚相互结合作用的研究较少。桔皮是一种优质膳食纤维的原料(高慧颖等,2019),经DHPM改性处理的桔皮膳食纤维在吸附茶多酚上具有良好的应用潜力,需进一步优化二者结合作用条件,并分析其复合物在消化环境中的稳定性。【拟解决的关键问题】以经DHPM改性处理的桔皮膳食纤维为载体,分析在不同的温度、时间、茶多酚浓度和pH条件下,改性桔皮膳食纤维对茶多酚吸附和结合性能的变化趋势;通过响应面法优化复合物的制备条件,并在模拟人工消化模型中比较分析茶多酚和复合物的稳定性差异,为茶多酚和膳食纤维在结肠功能性食品中的高效应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜建阳桔柚由福建省南平市建阳区桔柚专业合作社提供,取果皮在50℃下热风干燥至恒重,粉碎后过100目筛,制得桔皮粉末样品,密封干燥保存。茶多酚(纯度97%)购自上海麦克林生化科技有限公司;胃蛋白酶(P7000,来源于猪胃粘膜)、胰蛋白酶(T4799,来源于猪胰腺)和牛胆酸钠(S0900000)购自Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司;福林酚、氢氧化钠、无水乙醇、盐酸及其他药品试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。主要仪器设备:BSA电子分析天平(德国赛多利斯集团)、DGG-9140BD电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)、DF-101S磁力搅拌集热式水浴锅(上海力辰仪器科技有限公司)、ZWY-2102C恒温振荡摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)、L550台式大容量离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)和Lambda 35紫外可见分光光度计(美国珀金埃尔默公司)。

1.2 桔皮膳食纤维制备与改性处理

桔皮膳食纤维的制备和DHPM改性处理参照江文韬等(2020)的方法进行。将干燥桔皮粉末(20 g)与5% NaOH溶液按1∶20(g/mL)比例混合,在50℃下静置反应4 h后,将溶液离心(4000 r/min)10 min取下层沉淀,再将沉淀分散于0.5 mol/L NaCl溶液中(1∶25,g/mL),调pH至11.0,在40℃下持续搅拌3 h脱去蛋白;再次离心后,将沉淀按1∶20(g/mL)加入10% H2O2,在45℃下搅拌12 h以脱色;最后将沉淀用蒸馏水冲洗至pH为中性,50℃热风干燥后即得桔皮膳食纤维(CDF)。称取1 g CDF,搅拌分散在水中(1.5∶100,g/mL),在压力110 MPa下进行DHPM改性处理5次,所得样品热风干燥后,得到DHPM改性的桔皮膳食纤维(D-CDF)。

1.3 茶多酚含量测定

茶多酚含量的测定基于稍作修改的福林酚法(Hu and Du,2019)。分别配制浓度为10~60μg/mL的茶多酚溶液,绘制茶多酚标准曲线。将0.1 mL样品溶液转移至5 mL离心管中,加入1.0 mL稀释10倍的福林酚试剂并混匀,静置5 min后加入1.0 mL 7.5%(w/v)Na2CO3,室温避光保存60 min,用紫外—可见分光光度计在765 nm处测定吸光值,重复3次。根据茶多酚的标准曲线进行定量计算。

1.4 改性桔皮膳食纤维对茶多酚吸附性能研究

将50 mL离心管包上铝箔,称取0.5 g D-CDF粉末,与20 mL不同浓度和pH的茶多酚水溶液在离心管中混合,置于恒温振荡摇床中,在不同温度条件下100 r/min持续振荡。经不同吸附反应时间后,取出单只离心管,8000 r/min离心10 min,吸取上层清液,用紫外—可见分光光度计在765 nm处测定吸光值,根据茶多酚标准曲线计算上清液中游离茶多酚浓度。D-CDF对茶多酚的吸附量根据公式(1)计算:

式中,C0为初始溶液中茶多酚浓度(μg/mL),Ct为t时刻上清液中茶多酚浓度(μg/mL),V为反应时溶液总体积(mL),W为样品D-CDF质量(mg)。

初始条件设为茶多酚浓度1.0 mg/mL,吸附反应温度25℃,反应时间60 min,溶液pH 7.0。将不同温度设为5、15、25、35、45和55℃,时间设为15、30、60、120、180和240 min,茶多酚浓度设为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mg/mL,pH设为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。

1.5 改性桔皮膳食纤维吸附茶多酚条件的响应面法优化

在单因素试验结果的基础上,根据Box-Behnken试验设计原理,设计温度、时间、茶多酚浓度和pH为响应因素,茶多酚吸附量为响应值的4因素3水平响应面分析试验(表1)。优化后条件制备的改性桔皮膳食纤维与茶多酚的复合物溶液,经冻干后得到复合物粉末(DFTP),低温干燥保存,用于后续分析。

表1 Box-Behnken响应面试验设计因素与水平Table 1 Level and factor of Box-Behnken response surface design

1.6 复合物体外模拟消化的稳定性分析

参照王谢祎等(2016)的方法构建模拟消化模型,以纯茶多酚粉末为对照,研究复合物DFTP在体外模拟胃消化和肠道消化环境中的稳定性。人工模拟胃液采用0.1 mol/L HCl溶液配制4 mg/mL胃蛋白酶溶液,人工模拟肠液由0.1 mol/L NaHCO3溶液与2 mg/mL胰蛋白酶和12 mg/mL牛胆酸钠配制而成。

取100 mL具塞锥形瓶,分别加入25.0 mL生理盐水和4.0 mL人工胃液(4 mg/mL),混匀后,以0.1 mol/L HCl溶液调pH至2.0~2.5。在试验组中加入15 mg复合物DFTP,而对照组添加的茶多酚粉末重量根据茶多酚吸附量进行换算,以保证2组间具有相同的初始茶多酚含量。在37℃水浴中100 r/min振荡,模拟胃消化1 h后,将此消化液置于冰浴中钝化酶活。2组分别取样品溶液根据福林酚法测定茶多酚浓度。

在上述消化1 h的人工胃液中加入1.0 mol/L NaHCO3溶液调节pH至6.5~7.0,于37℃水浴振荡(100 r/min)45 min,加入1.8 mL模拟人工肠液,调节pH至7.0~7.5,继续于37℃水浴振荡2 h,转移至冰浴中钝化酶活。取样品溶液根据福林酚法测定茶多酚浓度。

在体外模拟消化的条件下,茶多酚保留率根据公式(2)计算:

式中,Qt为t时刻溶液中茶多酚浓度(mg/mL),Qs为消化初始阶段溶液中茶多酚浓度(mg/mL)。

1.7 统计分析

所有试验均为3次重复,结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0对试验数据进行差异显著性分析,以Excel 2019制图,使用Design-Expert V8.0.6对响应面试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 温度对改性桔皮膳食纤维吸附茶多酚的影响

如图1所示,改性桔皮膳食纤维对茶多酚的吸附量随温度的升高而减少。当反应温度为5℃时,茶多酚吸附量最高,达47.68±1.97 mg/g;而当温度升至55℃时,茶多酚吸附量显著降至21.36±1.22 mg/g(P<0.05,下同)。研究表明,纤维与多酚之间的结合主要是通过氢键介导的非共价作用,当多酚与纤维表面的结合位点进行接触,形成的氢键使得二者结合更加紧密(Renard et al.,2001)。温度升高引起茶多酚分子运动加剧,从而减弱氢键结合作用,导致茶多酚吸附量的减少。

2.2 时间对改性桔皮膳食纤维吸附茶多酚的影响

改性桔皮膳食纤维分散于茶多酚溶液后,随着吸附反应时间的延长,二者的吸附结合经历自发快速的初始阶段与平稳且缓慢的扩展阶段。如图2所示,在15~60 min,由于纤维表面的结合位点数量充足,改性桔皮膳食纤维与茶多酚自发快速地结合(Liu et al.,2018),茶多酚吸附量随着时间的延长而显著提高;吸附60 min时,茶多酚吸附量达38.64±1.26 mg/g。当吸附反应时间超60 min后,改性桔皮膳食纤维与茶多酚的结合趋于饱和,表现为结合速率明显放缓,吸附量基本保持不变,在反应时间为240 min时,茶多酚吸附量为39.59±1.66 mg/g。这可能是由于纤维表面的结合位点逐渐饱和,少量游离茶多酚只能通过多酚分子间缔合堆叠进行吸附结合,导致结合速率快速下降。

2.3 茶多酚浓度对改性桔皮膳食纤维吸附茶多酚的影响

由图3可知,随着茶多酚浓度的增大,改性桔皮膳食纤维对茶多酚的吸附量逐渐提高;当茶多酚浓度大于3.0 mg/mL时,其吸附量趋于饱和。结果表明,纤维与茶多酚的结合受到溶液中游离酚浓度的影响。由于溶液中的结合酚与游离酚存在动态平衡,因此增加茶多酚溶液中游离酚含量在一定浓度范围内可使得纤维对茶多酚吸附能力提高。

2.4 pH对改性桔皮膳食纤维吸附茶多酚的影响

溶液pH是影响茶多酚吸附的重要因素之一,因此需对其进行优化以实现茶多酚的高效吸附(阳雁等,2015)。如图4所示,茶多酚吸附量随着溶液pH的增加而提高,当pH为7.0时,茶多酚吸附量达最大值(40.49±1.44 mg/g),之后逐渐下降。因此,不论是酸性或碱性环境均不利于茶多酚与膳食纤维的吸附结合作用。

2.5 响应面试验结果

2.5.1 响应面试验结果及方差分析采用Design-Expert V8.0.6对表2的试验数据进行二次响应面回归拟合分析,得到以温度(A)、时间(B)、茶多酚浓度(C)和pH(D)为自变量,茶多酚吸附量(Y)为因变量的二次多项式回归方程:Y=45.79-7.97A+3.77B+2.47C-0.19D-0.50AB+0.56AC-0.28AD+0.22BC+0.085BD-0.065CD+0.092A2-3.50B2-2.61C2-4.15D2。模型的P<0.01,说明该回归模型极显著,失拟项(P=0.9969)不显著(P>0.05,下同)(表3),表明该模型的拟合程度好,试验误差小,可较好地反映茶多酚吸附量与温度、时间、茶多酚浓度和pH之间的关系,较准确地预测改性桔皮膳食纤维对茶多酚的吸附作用。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表3可知,一次项A、B、C对茶多酚吸附量的影响均达极显著水平(P<0.01),4个因素对茶多酚吸附量的影响程度排序为A>B>C>D,即温度>时间>茶多酚浓度>pH。交互项AB和AC对茶多酚吸附量的影响达显著水平,表明温度与时间、温度与茶多酚浓度的交互作用对茶多酚吸附量有显著影响。

表3 回归方程系数显著性分析结果Table 3 Regression equation coefficient significance analysis results

2.5.2 各因素间交互作用分析响应面交互作用的结果如图5所示。图5-a和图5-b显示,茶多酚吸附量随着温度的升高而快速下降,随着时间的延长和茶多酚浓度的增加先升高后趋于稳定,等高线稀疏均匀,表明温度与时间之间、温度与茶多酚浓度之间均具有显著的交互作用,能显著影响改性桔皮膳食纤维对茶多酚的吸附量;等高线图中时间曲线与茶多酚浓度曲线较温度曲线平缓,说明时间和茶多酚浓度2个因素对茶多酚的吸附量影响不如温度。图5-c显示,等高线呈不规则曲面,表明温度与pH的交互作用不显著。图5-d~图5-f显示,响应面的坡度较平缓,等高线呈近圆形,表明时间与茶多酚浓度、时间与pH、茶多酚浓度与pH的交互作用不显著,pH与其他各因素间无显著交互作用,不能显著影响改性桔皮膳食纤维对茶多酚的吸附量。以上各因素交互作用与方差分析结果一致。

2.5.3 验证试验结果利用上述模型,以茶多酚吸附量为最大值,预测改性桔皮膳食纤维吸附茶多酚最优条件为:温度4.83℃,时间60.77 min,茶多酚浓度3.89 mg/mL,pH 6.85,此时茶多酚吸附量为54.46 mg/g。考虑到实际操作,将优化后的参数调整为:温度5℃,时间61 min,茶多酚浓度3.9 mg/mL,pH 7.0。采用上述调整后的工艺条件进行验证试验,在此条件下进行3次平行验证,茶多酚吸附量平均值为54.26 mg/g,与理论预测值误差小于1%,说明采用响应面法优化得到的工艺条件可靠,利用该模型预测改性桔皮膳食纤维对茶多酚吸附结合作用可行。

2.6 复合物在体外模拟消化环境中的稳定性

体外模拟消化试验结果(图6)表明,茶多酚在模拟胃肠消化环境中含量显著降低。茶多酚经胃消化后的保留率为84.17%,再经肠道消化后保留率仅为47.29%。当茶多酚与改性桔皮膳食纤维通过吸附结合形成复合物后,在膳食纤维的保护下可降低胃肠消化环境对茶多酚的破坏作用,显著提升茶多酚在消化环境中的稳定性,经模拟胃和肠道消化后的茶多酚保留率分别为92.07%和69.73%。

3 讨论

植物膳食纤维主要来源于植物细胞壁,包括纤维素、木质素、半纤维素和果胶等。随着生活水平的提高,我国居民的日常饮食结构发生变化,膳食纤维摄入量呈下降趋势,在食品中补充膳食纤维对于预防多种慢性疾病具有重要意义(扈晓杰等,2011)。近年来,膳食纤维对多酚的吸附和保护作用也逐渐受到重视,被广泛认为是膳食纤维的重要生理功能之一。研究表明,膳食纤维主要通过非共价键作用力与多酚形成稳定的复合物,从而提高多酚在不同环境中的生物稳定性和生物活性(王丽颖等,2017)。

茶多酚是茶叶所含有的重要活性成分,具有清除机体内自由基、延缓机体衰老、预防心血管疾病、防癌等生物活性功能。利用膳食纤维与多酚结合形成的复合物可保护多酚达到结肠,被肠道菌群分解与代谢,进而协同发挥其对人体的健康功效。本研究将桔皮膳食纤维经DHPM改性处理后,测定分析4个因素(时间、温度、茶多酚浓度和pH)对茶多酚吸附量的影响。结果表明,随着时间的变化,改性桔皮膳食纤维对茶多酚的吸附可分为自发快速的初始阶段(15~60 min)与平稳且缓慢的扩展阶段(>60 min)。在初始阶段,茶多酚分子可迅速通过非共价键作用与膳食纤维表面的结合位点结合;进入扩展阶段后,由于缺乏新的结合位点,未结合的多酚以极缓慢的速率在结合物表面发生缔合堆叠。温度是影响酚类物质与膳食纤维结合的另一个关键因素。当温度为5℃时,茶多酚吸附量为47.68±1.97 mg/g,并随着温度的升高而逐渐下降。反应溶液温度的升高会导致酚类物质与膳食纤维结合力下降,这是由于温度升高减弱二者的非共价相互作用,主要影响氢键作用,不利于结合(Phan et al.,2015)。茶多酚浓度越高,溶液中的游离茶多酚分子越多,与膳食纤维的吸附结合速率就越快。在相同的吸附反应时间内,吸附量在茶多酚浓度为3.0 mg/mL时趋于饱和。不同溶液pH对茶多酚吸附量有明显影响,溶液pH为7.0时,茶多酚吸附量达最大值。响应面法结果表明,各因素对茶多酚吸附量的影响程度由高到低依次为温度、时间、茶多酚浓度和pH,且温度与时间、温度与茶多酚浓度的交互作用对茶多酚吸附量有显著影响。进而将改性桔皮膳食纤维吸附茶多酚条件优化为:温度5℃,时间61 min,茶多酚浓度3.9 mg/mL,pH 7.0。在该优化条件下得到茶多酚吸附量为54.26 mg/g,优于骆慧敏等(2015)报道多孔淀粉对茶多酚的吸附量(25.72 mg/g),与吴培龙等(2010)报道玉米多孔淀粉的茶多酚吸附量(68.65 mg/g)相近。

桔皮膳食纤维作为茶多酚的保护和结肠靶向递送载体具有以下几个优势:(1)膳食纤维与多酚分子之间具有很强的相互结合作用力;(2)膳食纤维具有良好的结肠黏膜黏连能力;(3)膳食纤维可与多酚发挥协同益生元效应(Tang et al.,2020)。体外模拟消化试验结果表明,茶多酚在经模拟胃消化(1 h)和肠道消化(2 h)后,保留率分别为84.17%和47.29%,与李玉壬等(2021)的研究结果(88.00%和63.90%)相近。茶多酚在胃肠不同的酸碱环境、消化酶等共同作用下,发生氧化、聚合、降解等反应,导致其含量显著降低。相对于胃部环境,肠道中的弱碱性化学条件和酶的共同作用对茶多酚的稳定性造成更显著影响(Tenore et al.,2015)。茶多酚与桔皮膳食纤维通过吸附结合形成稳定的复合物,并经相同的模拟胃肠消化环境后,茶多酚保留率分别达92.07%和69.73%,显著高于未经保护的纯茶多酚。本研究开展DHPM改性桔皮膳食纤维吸附茶多酚的条件优化及其体外模拟消化稳定性研究,结果证明改性桔皮膳食纤维通过吸附茶多酚可显著提升其生物稳定性,有利于实现茶多酚的结肠靶向递送。然而,由于技术手段的局限性,以及茶多酚与改性桔皮膳食纤维分子间相互作用的复杂性,使得二者之间相互作用的影响因素和作用机制研究不够深入和全面,结合位点及连接与释放方式仍需进一步研究。

4 结论

DHPM改性桔皮膳食纤维可作为吸附茶多酚的高效天然载体,通过条件的优化,可显著提高茶多酚在胃肠道中的稳定性,有利于递送茶多酚进入结肠中发挥其健康功效。

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