当归芪枣精及其拆方对气血两虚模型小鼠的药效作用研究*

张 雷，朱 卫，黄 豫，蒋洁君

（昆山市中医医院，江苏 昆山 215300）

气血是人体维系正常生命活动的根本，现代人常因饮食作息不规律、思虑劳神过度或久病不愈导致气血生化失调，出现气血两伤的症状，主要表现为疲劳乏力、心悸气短、盗汗失眠、面色淡白或萎黄[1]。中医学认为，气能生血，血能载气，进而气推血行，令人体气血充盈，机能恢复平和[2]。当归补血汤以黄芪和当归组方，是益气生血的经典名方。有研究[3]发现该方对糖尿病肾病、心脑血管疾病、肝脏疾病、免疫系统疾病等有多种共同作用靶点，但详细机制尚不清晰。大枣作为气血双补的药食两用之物，被《神农本草经》列为上品，兼具调节免疫、抗疲劳和造血作用[4]；此外，大枣还能保护肝脏、增强体力[5]，可通过抑制促炎性细胞因子的释放发挥抗炎潜能[6]。当归芪枣精为我院临床应用多年的品种，由当归补血汤增加大枣而成，用于治疗各类气血两虚证，但还缺乏作用机制的具体阐述，也未见有大枣发挥协同增效作用的文献报道，有必要对其科学内涵进行深入研究。

因此，为阐明当归芪枣精的组方合理性和科学作用机制，本研究选用腹腔注射环磷酰胺合并尾部放血的方法来建立气血两虚小鼠模型[1]，考察当归芪枣精以及拆方药味对气血两虚证的干预作用，以期为开展经方应用研究提供一个全新视角[7]。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄SPF级昆明种雄性小鼠24只，体质量（20±2）g，购自卡文斯百格（苏州）模式动物研究有限公司，动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0002；小鼠饲养于SPF级动物房3 d，环境温度控制在（26±2）℃，相对湿度为40%～70%，12 h/12 h光照昼夜循环。实验结束后小鼠采用颈椎脱臼处死，本实验严格按动物伦理要求进行。

1.2 药物与试剂 当归芪枣精（处方组成：黄芪26 g，当归13 g，大枣10 g）和芪归组（处方组成：黄芪26 g，当归13 g）药材经昆山市中医医院吴学荣主任中药师鉴定符合2020年版《中华人民共和国药典》规定，由制剂室煎煮提取而成；注射用环磷酰胺（批号：H22026738）购自上海华联制药有限公司；IL-6 ELISA试剂盒（批号：20210814006）、IL-1β ELISA试剂盒（批号：20210825112）、苏木精/伊红染料（批号：XRL3007）均购自上海信帆生物科技有限公司；甲醛（批号：100100008）、二甲苯（批号：100234192）、无水乙醇（批号：100092680）、冰醋酸（批号：A35-500）、甘油（批号：A16205）均购自国药集团化学试剂有限公司；逆转录试剂盒（批号：01139728）购自Fermentas公司；SYBR Green PCR试剂盒（批号：01305540）购自Thermo公司。

1.3 主要仪器 XT2000i型全自动血细胞分析仪（上海Sysmex医用电子有限公司）；TG-16M型低温冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；352型酶标仪（芬兰Labsystems Multiskan MS公司）；AC8型洗板机（芬兰Thermo Labsystems公司）；CX4型光学显微镜（日本OLYMPUS公司）；旋涡振荡器（上海青浦沪西仪器厂）；FA25-D电动匀浆机（上海FLUKO公司）；SQ2125石蜡切片机、PPTHK-21B摊片机（湖北徕克医疗仪器有限公司）；D5100数码相机（日本NIKON公司）。

1.4 造模与分组 24只小鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组、芪归组、当归芪枣精组，每组6只。参考文献[1，8]建模方法，除对照组外，其余3组小鼠于给药第1天每鼠尾部放血约0.5 mL，隔日放血1次，连续放血4次；于给药第3天每鼠腹腔注射环磷酰胺，80 mg/kg（相当于给药体积为8 mL/kg），隔日注射1次，连续注射3次。对照组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水。所有小鼠注射前均需禁食不禁水12 h。根据行为学及形态学相应的测试指标，若模型组大鼠负重游泳时长、胸腺皮质厚度、皮质细胞数与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），则说明造模成功。

1.5 药物制备及实验给药 按处方配比，分别称取当归芪枣精组（当归、黄芪和大枣）、芪归组（当归、黄芪）药物，加入8倍量水浸泡30 min，回流提取2 h，再加入6倍量水，回流提取1 h，过滤后合并药液，以生药量计，当归芪枣精组及芪归组浓缩至质量浓度分别为0.49、0.39 g/mL。对照组与模型组小鼠给予10 mL/kg生理盐水灌胃；按照人和小鼠间体表面积折算的等效剂量比计算，芪归组、当归芪枣精组的药物剂量分别为5.07、6.37 g/（kg·d），连续7 d。

1.6 观察指标

1.6.1 负重游泳实验[1]末次给药后，各组小鼠尾部捆缚自身体质量6%的不锈钢丝，置于温度（30±3）℃、深度40 cm水中，以鼠头部10 s内无法浮出水面为标准，记为其游泳终止时间，记录入水至游泳终止的时长，作为抗疲劳的体能指标。

1.6.2 血常规和IL-6、IL-1β水平 末次给药后，禁食不禁水12 h，称体质量。剪尾取血50 μL置于EDTA-3K抗凝管中，充分摇匀后于全自动血细胞分析仪中进行分析，检测WBC、RBC、PLT及HGB；取眼眶血静置15 min，3 000 r/min离心20 min后，取血清，参照ELISA试剂盒说明书进行IL-6、IL-1β的含量检测。

1.6.3 胸腺皮质厚度和皮质细胞数 末次给药24 h后，处死小鼠，取小鼠胸腺组织，用生理盐水冲洗完整的胸腺，去除筋膜和脂肪组织，在显微镜下用测微尺测定胸腺皮质厚度，并于最宽处和最窄处计算压在测微尺基线上的细胞数，每只小鼠测5处，求平均值。

1.6.4 胸腺组织学观察 末次给药24 h后，脱颈椎处死小鼠并摘取胸腺，待样本用福尔马林溶液浸泡48 h后，用乙醇梯度脱水，经二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡流程后，再采取苏木素染色、氨水溶液水化、伊红复染、乙醇脱水和二甲苯透明，最后以中性树胶封片，待干燥后在光学显微镜下镜检，并进行图像采集分析[9]。

1.6.5 骨髓组织GM-CSF mRNA、EPO mRNA表达情况 取小鼠右侧完整股骨，除净软组织，用2号注射器吸取3%的醋酸溶液5 mL，从股骨两侧反复冲洗，收集骨髓，匀浆30 s后加入700 μL Trizol裂解细胞，经吹打混匀提取骨髓细胞总RNA，-80 ℃冰箱保存备用[10]。分别按照逆转录和荧光定量试剂盒说明书进行操作，在荧光定量PCR仪上反应。反应体系：SYBRGreen Mix（×2）5 μL，Primer F（10 μmol/L）0.1 μL，Primer R（10 μmol/L）0.1 μL，cDNA 2 μL，加水补齐至11 μL。引物序列见表1，以β-actin（GADPH）作为内参基因。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火及延伸45 s，共40个循环，结束后95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s做熔解曲线分析[11]。最后，对相关数据信息进行分析。（见表1）

表1 PCR 引物序列

1.7 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行分析，计量资料以“均数±标准差”（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验[12]，以P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠负重游泳时长比较 与对照组比较，模型组小鼠负重游泳时长明显缩短（P＜0.01）；与模型组比较，当归芪枣精组小鼠负重游泳时长明显延长（P＜0.05）；芪归组小鼠负重游泳时长与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组小鼠负重游泳时长比较（）

表2 各组小鼠负重游泳时长比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05

2.2 各组小鼠血常规指标比较 与对照组比较，模型组小鼠血液中WBC、RBC、PLT及HGB均明显降低（P＜0.01），提示造模成功。与模型组比较，当归芪枣精组小鼠血液中WBC、RBC、PLT及HGB均明显升高（P＜0.01)，芪归组小鼠血液中PLT明显升高（P＜0.05）；当归芪枣精组小鼠血液中WBC、RBC高于芪归组（P＜0.05）。（见表3）

表3 各组小鼠血常规指标比较（）

表3 各组小鼠血常规指标比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与芪归组比较，dP＜0.05

2.3 各组小鼠血清IL-6、IL-1β水平比较 与对照组比较，模型组小鼠血清IL-6、IL-1β水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，芪归组、当归芪枣精组小鼠血清IL-6、IL-1β水平均明显升高（P＜0.01），且当归芪枣精组小鼠血清IL-6、IL-1β水平明显高于芪归组（P＜0.01或P＜0.05）。（见表4）

表4 各组小鼠血清IL-6、IL-1β 水平比较（）

表4 各组小鼠血清IL-6、IL-1β 水平比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与芪归组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

2.4 各组小鼠胸腺组织病理学变化情况 对照组小鼠胸腺组织皮质、髓质分界明显，皮质区淋巴细胞排列整齐，髓质区可见胸腺小体；模型组小鼠胸腺组织皮质变薄，淋巴细胞数量明显减少、结构间隙变大，有的细胞胞浆内甚至有空泡存在，表明气血两虚小鼠模型造模成功[13]；当归芪枣精组小鼠胸腺组织皮质、髓质分界较为清晰，空泡现象得到扭转，细胞密度有所增加；芪归组小鼠胸腺组织病变结构虽有一定改善，但皮质、髓质分界仍较模糊，细胞间隙仍未愈合完全[14]。（见图1）

图1 各组小鼠胸腺组织病理切片图（HE，×200）

与对照组比较，模型组小鼠胸腺皮质厚度、皮质细胞数均明显减少（P＜0.01）；与模型组比较，芪归组、当归芪枣精组小鼠胸腺皮质厚度、皮质细胞数均明显增加（P＜0.01），且当归芪枣精组小鼠胸腺皮质厚度、皮质细胞数明显高于芪归组（P＜0.01）。（见表5）

表5 各组小鼠小鼠胸腺皮质厚度、皮质细胞数比较（）

表5 各组小鼠小鼠胸腺皮质厚度、皮质细胞数比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与芪归组比较，cP＜0.01

2.5 各组小鼠骨髓组织GM-CSF mRNA、EPO mRNA表达水平比较 与对照组比较，模型组小鼠骨髓组织GM-CSF mRNA、EPO mRNA相对表达量均明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，当归芪枣精组小鼠骨髓组织GM-CSF mRNA、EPO mRNA相对表达量均明显升高（P＜0.01），且当归芪枣精组骨髓组织GM-CSF mRNA、EPO mRNA相对表达量明显高于芪归组（P＜0.05）。（见表6、图2）

图2 PCR 扩增曲线

表6 各组小鼠骨髓组织中GM-CSF mRNA、EPO mRNA相对表达量比较（）

表6 各组小鼠骨髓组织中GM-CSF mRNA、EPO mRNA相对表达量比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与芪归组比较，cP＜0.05

3 讨论

气血是人体正常运行的根本，气虚则血亏，血虚则气散，两者相辅相成，临床上发生病变时多演变为气血两虚，故治疗时常治以补血益气之法，取“气能生血，血能载气”之理。气血两虚证可能会出现在不同的疾病中，根据中医“异病同治”的辨证论治原则，在治疗时都可以采用补益气血的方法，但方剂配伍却各有侧重。当归、黄芪为常用中药[15]，这体现了养血、补气的基本治则，而大枣则兼具两者之功，三者配伍是否有协同增效作用值得探讨。故本研究采用放血联合注射环磷酰胺的方法成功建立气血两虚证小鼠模型，用拆方手段来考察大枣对于当归芪枣精的作用，探究其是否有助于提升气血、促进造血功能和改善微循环等药理作用[1]。

本研究表明，当归芪枣精能显著改善气血两虚小鼠胸腺的病理形态，能有效缓解胸腺皮质变薄，使细胞间隙紧密，显著增加淋巴细胞数量。为考量小鼠抗疲劳能力，本实验运用经典的负重游泳时长实验来直观反映小鼠肌肉运动能力，结果显示当归芪枣精可延长小鼠负重游泳时间，发挥了抗疲劳作用，起到了补气的效果[16]。作为一种多能造血干细胞生长因子，IL-1β能诱导成纤维细胞和内皮细胞释放集落刺激因子，促进骨髓原始造血细胞集落增殖，还与其诱生的细胞因子协同刺激促成血细胞生长，同时IL-1β能通过加速细胞循环促进骨髓造血干细胞的生存，对机体造血起正调节作用，其含量的动态变化直接反映了骨髓造血功能的强弱[17]。细胞因子IL-6则由IL-1β诱生，能发挥多重免疫调节功能[18]。病理早期IL-6分泌量的增加会激发多种炎症因子的瀑布式释放，由此形成的炎症反应会损伤组织细胞，但此后IL-6则充当起系统性宿主防御反应的协调员，通过促进中性粒细胞的活化、聚集起到增强免疫的作用[19]。本实验结果显示，当归芪枣精通过同步上调小鼠血清中IL-1β和IL-6的表达，协同促进机体造血，还可有效发挥抗炎和免疫调节作用，且当归芪枣精组各项指标均优于芪归组。

骨髓是血液生成的主要场所，外周血中RBC、WBC、PLT、HGB等客观指标则能间接反映其造血状态。GM-CSF具有广谱效应，这种多肽生长因子对早期造血祖细胞增殖具有广泛促进活性，但有赖于骨髓基质细胞提供分泌场所；EPO则是一种激素糖蛋白，能特异性作用于红系祖细胞进而刺激骨髓造血，可与GM-CSF产生协同作用，可增加红细胞、多能干细胞集落的形成。因此，本实验通过建立放血和CTX诱导的气血两虚小鼠模型，检测骨髓部位的GM-CSF mRNA、EPO mRNA表达，以探讨造血机能的变化。研究结果显示，CTX损害了小鼠骨髓的造血机能，导致RBC、WBC、PLT和HGB含量的显著减少，抑制了GM-CSF mRNA、EPO mRNA的表达，出现了贫血症状。结果显示，当归芪枣精明显改善了气血两虚模型小鼠的血象，且能全面提高RBC、WBC、PLT和HGB含量，促进GM-CSF mRNA、EPO mRNA的表达，具有改善血虚的作用，但芪归组疗效明显低于当归芪枣精组，仅PLT指标有所上升。可见，当归芪枣精可以促进受到抑制的小鼠骨髓造血祖细胞的增殖，使GM-CSF、EPO表达明显上调[20]，提示其可能通过多途径、多靶点刺激机体多种造血生长因子分泌，进而促进骨髓造血功能损伤的恢复，从而发挥其“补血”功效[21]。此外，与芪归组比较，当归芪枣精的提升作用更为显著。

综上所述，当归芪枣精对气血两虚的改善作用可能是通过修复受损胸腺，增加淋巴细胞的数量，上调血清中IL-6、IL-1β的表达，从而增强小鼠免疫能力，促进体力恢复；当归芪枣精还可有效改善血象，增强小鼠骨髓中EPO mRNA、GM-CSF mRNA的表达；这可能是其促进造血，发挥补血功效的机制之一[22]。当归芪枣精对小鼠气血两虚体征的改善，为进一步阐明当归芪枣精的多途径、多靶点作用机制提供了实验依据。