柳蘑的低极性化学成分研究*

尹昭晔，孔炯炜，乔丽菲，赵婷，刘湘，赵引利

（武安市第一人民医院，河北 武安 056300）

柳蘑学名毛栓菌Trametes hirsute（Wulf.Fr.）Pilat属于担子菌纲多孔菌目多孔菌科，毛栓菌多生于杨树和柳树的活立木、枯立木或伐木桩上，分布于我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、河南、山东、山西、陕西、四川、安徽、江苏、浙江、广东、海南、甘肃等地区[1]。柳蘑是民间习用的治癣菌类生药，具有消炎解毒、止痒的功效，用于治疗牛皮癣、干癣、风癣及神经性皮炎，临床疗效良好[2]。柳蘑治疗癣症疗效确切，目前已有柳蘑作为药物活性成分的制剂上市销售，用于皮肤疾病治疗，临床效果显著，但其药效物质基础不明确，没有合理质控方案。本实验从上市制剂的制备工艺考虑，重点对其脂溶性成分进行了系统的提取分离，以期获得其药效物质基础，为该药物质控提供依据。

1 材料与仪器

毛栓菌为天津达仁堂京万红药业有限公司提供，经天津中医药大学赵扬教授鉴定为担子菌纲多孔菌目多孔菌科毛栓菌。电子辍击离子源-质谱联法（EI-MS）测定用LC-MS-8080质谱仪（日本岛津公司），核磁共振（NMR）测定用Bruker ARX300和Bruker AV600核磁共振仪（瑞士Bruker公司），LC-20AP制备型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司），半制备液相所用试剂均为色谱纯（美国Fisher公司），柱层析及薄层硅胶为青岛海洋化工分厂生产，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取与分离 本实验取预粉好的毛栓菌药粉4.0 kg，95%乙醇超声提取2次，1 h/次，每次溶剂用量均为20倍量（kg/L），合并两次提取，滤过，60 ℃减压回收溶剂至乙醇回收完全，得浓缩液；将浓缩液用纯化水1∶1稀释，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，低温回收溶剂至干，得乙酸乙酯萃取干膏42 g。经硅胶柱色谱，用石油醚-丙酮梯度洗脱，调节石油醚∶丙酮体积依次为100∶0、100∶1、100∶2、100∶3、100∶4、100∶6、100：8、100∶12、100∶15、100∶20、100∶30、100∶50、100∶100，然后丙酮、甲醇洗脱，薄层监测合并相同流分，回收溶剂，取出100∶1的流分，其余流分留存备用。石油醚-丙酮为100∶1洗脱液的四至六流分中有大量无色针晶析出，滤过分离晶体与母液，得到混合物618 mg，加甲醇至溶解完全，RP-HPLC进样分析其纯度，98%甲醇-水洗脱，203 nm紫外检测，得到4个色谱峰（见图1），换取制备色谱柱SHIM-pack PRC-ODS（20 mm×250 mm，5 μm），二极管阵列检测器，检测波长为203 nm，柱温为室温，98%甲醇-水洗脱，流速为3 mL/min。逐步加大进样量对4个色谱峰做分离制备，回收制备液低温干燥得到4种纯品化合物，经称质量得到化合物1（72 mg）、化合物2（126 mg）、化合物3（51 mg）和化合物4（82 mg）。

图1 制备色谱图的四至六流分

2.2 结构鉴定 经EI-MS（m/z）结合核磁共振图谱进行结构鉴定。化合物1易溶于三氯甲烷，EI-MS测定分子离子峰m/z 394，结合1H-NMR图谱，确定该化合物分子式为C28H42O。1H-NMR（300 MHz，CDCl3），δ5.66（1H，m，olefinic ring H），5.50（1H，m，olefinic ring H），5.39（1H，m，olefinic ring H），5.18（2H，m，H-22，23），3.60（1H，m，H-3），1.23（3H，s，H3-19），1.00（3H，d，J=6.5 Hz，H3-21），0.90（3H，d，J=7.0Hz，H3-28），0.82（3H，d，J=6.0Hz，H3-26 or 27），0.81（3H，d，J=6.0Hz，H3-26 or 27），0.56（3H，s，H-18）。仔细分析图谱数据，并经详细检索SciFinder数据库，与已知化合物文献数据[3]进行比较分析，确定化合物1结构是（22E）-ergosta-5，7，9（11），22-tetraen-3β-ol，即（22E）-麦角甾-5，7，9（11），22-四烯-3β-醇。

化合物2易溶于三氯甲烷，EI-MS测定分子离子峰m/z 396，结合1H-NMR，13C-NMR图谱，确定该化合物分子式为C28H44O。1H-NMR（300 MHz，CDCl3），δ1.03（3H，d，J=6.9 Hz，H3-21），0.94（3H，S，H3-19），0.91（3H，d，J=6.9Hz，H3-28），0.84（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26 or H3-27），0.82（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26 or H3-27），0.63（3H，S，H3-18），5.56（1H，dd，J=2.5，5.7 Hz，H-6），5.38（1H，m，H-7），5.19（2H，m）。13C-NMR（600MHz，CDCl3），δ38.34（C-1），31.95（C-2），70.45（C-3），40.75（C-4），139.75（C-5），119.56（C-6），116.25（C-7），141.36（C-8），46.21（C-9），37.00（C-10），21.08（C-11），39.05（C-12），42.79（C-13），54.53（C-14），22.97（C-15），28.27（C-16），55.69（C-17），12.03（C-18），16.26（C-19），40.42（C-20），21.08（C-21），135.54（C-22），131.94（C-23），42.79（C-24），33.06（C-25），19.93（C-26），19.62（C-27），17.58（C-28）。仔细分析图谱数据，并经详细检索SciFinder数据库，与已知化合物文献数据[4]进行比较分析，确定化合物2结构是（24R）-ergosta-5，7，22-trien-3β-ol，即麦角甾醇。

化合物3易溶于三氯甲烷，EI-MS测定分子离子峰m/z 398，结合1H-NMR，13C-NMR图谱，确定该化合物分子式为C28H46O。1H-NMR（300 MHz，CDCl3），δ5.21-5.17（3H，m，H-7，H-22，H-23），3.57（1H，m，H-3），1.01（3H，d，J=6.6Hz，H3-21），0.91（3H，d，J=6.9 Hz，H3-28），0.84（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26），0.82（3H，d，J=6.6 Hz，H3-27），0.79（3H，s，H3-19），0.54（3H，s，H3-18）。13C-NMR（600 MHz，CDCl3），δ37.34（C-1），29.83（C-2），71.26（C-3），38.18（C-4），40.45（C-5），31.67（C-6），117.66（C-7），139.77（C-8），49.64（C-9），34.42（C-10），21.74（C-11），39.64（C-12），43.50（C-13），55.30（C-14），23.13（C-15），28.32（C-16），56.14（C-17），12.29（C-18），13.25（C-19），40.70（C-20），21.32（C-21），135.87（C-22），132.07（C-23），43.01（C-24），33.29（C-25），17.81（C-26），19.85（C-27），20.16（C-28）。仔细分析图谱数据，并经详细检索SciFinder数据库，与已知化合物文献数据[5-8]进行比较分析，确定化合物3结构是（22E，24R）-ergosta-7，22-dien-3β-ol，即（22E，24R）-麦角甾-7，22-二烯-3β-醇。

化合物4易溶于三氯甲烷，EI-MS测定分子离子峰m/z 400，结合1H-NMR，13C-NMR图谱，确定该化合物分子式为C28H48O。1H-NMR（300 MHz，CDCl3），δ0.92（3H，d，J=6.3 Hz，H3-21），0.79（3H，S，H3-19），0.77（3H，d，J=6.8 Hz，H3-28），0.78（3H，d，J=6.9 Hz，H3-26），0.85（3H，d，J=6.9 Hz，H3-27），0.53（3H，S，H3-18），3.61（1H，m，H-3），5.15（1H，m，H-7）。13C-NMR（600 MHz，CDCl3），δ37.31（C-1），31.64（C-2），71.25（C-3），38.15（C-4），40.42（C-5），29.82（C-6），117.59（C-7），139.81（C-8），49.61（C-9），34.38（C-10），21.72（C-11），39.72（C-12），43.55（C-13），55.20（C-14），23.14（C-15），28.09（C-16），56.17（C-17），12.02（C-18），13.22（C-19），36.80（C-20），19.20（C-21），33.83（C-22），30.86（C-23），39.23（C-24），31.64（C-25），20.71（C-26），17.75（C-27），15.61（C-28）。仔细分析图谱数据，并经详细检索SciFinder数据库，与已知化合物文献数据[9-10]进行比较分析，确定化合物4结构是（24S）-ergosta-7-en-3β-ol，即（24S）-麦角甾-7-烯-3β-醇。

3 讨论

柳蘑主要分布于我国河北省及东三省地区，其种类繁多，产地不同，品种也有很大差异。本实验选择的柳蘑药材经过了赵扬教授的鉴定，确定其为担子菌纲多孔菌目多孔菌科毛栓菌。

中药的传统提取方法存在诸多缺点，而超声提取作为一种新兴技术，近来应用颇多，与传统提取方法相比有着显著的优点：（1）常压萃取，安全性好，操作简单易行，简化样品提取的前处理过程；（2）提取时间短，加速有效成分溶解；（3）提取温度低；（4）适应性广；（5）提取药液杂质少，有效成分易于分离、纯化[11-14]。柳蘑药粉颗粒过于细小，若用传统回流提取法等提取常会因药粉积聚过密甚至结块而造成提取困难，提取效率低下，本实验根据超声提取本身可让提取液不断震荡致松散的特点并借鉴前人实验的经验，综合二者的利与弊，选择了超声提取方法，实验结果表明超声提取方法是提取柳蘑药粉行之有效的方法。

柳蘑是民间习用的治癣菌类生药，具有消炎解毒，止痒的功效，其油膏剂已收入《卫生部药品标准中药成方制剂第十五册》，用于治疗牛皮癣、干癣、风癣及神经性皮炎，临床疗效良好。本实验结合上市制剂的制备工艺，选择性地提取脂溶性成分，采用分析型液相色谱检测完晶体成分后，直接换取半制备型色谱柱以提高柱载样量，再适当加大进样量，快捷地分离获得足够的样品。通过收集同一色谱峰，并回收溶剂得到4个单体化合物，均为麦角甾类化合物。经1H-NMR、13C-NMR等数据分析，并与文献进行对照鉴定了结构，化合物1、2、3、4为首次从该植物中分离得到。麦角甾醇是真菌类的特征甾醇，药理作用广泛，近年来有较多研究报道麦角甾醇及其衍生物具有抗炎活性[15-16]，其主要通过抑制NO产生和抑制细胞因子释放，从而达到抗炎的效果。结合上市柳蘑软膏的主治功效，推测麦角甾醇及其衍生物是上市制剂起效成分。