水木和宁方通过调控泛素-蛋白酶体通路对MPP+诱导帕金森病体外模型细胞损伤的影响*

张天琪，李传成，邱朝阳，刘萍，翟茜茜，霍青

（1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.临沂市中心医院，山东 临沂 276400；3.潍坊医学院，山东 潍坊 261000；4.山东省妇幼保健院，山东 济南 250014；5.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是人类第二大常见的神经退行性疾病，目前全球患病人数已超过600万，其病理特征包括路易小体和路易神经突起形式的神经包涵体、黑质和其他脑区的细胞丢失[1-3]。泛素-蛋白酶体通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是体内重要的非溶酶体蛋白降解途径，功能缺陷时蛋白质不能及时降解，细胞氧化应激水平上升，促使DA神经元变性、凋亡，从而导致PD的发生[4-6]。本病治疗以左旋多巴制剂、多巴胺能受体激动剂、抗胆碱能制剂等为主，尽管在一定程度上减轻了症状，但仍然无法阻止或逆转疾病进展，且随着疾病的进展，药物的疗效会逐渐减弱[7]。长期使用还可能出现“开关现象”、“剂末现象”、肌张力运动障碍等运动并发症[8]。水木和宁方是霍青经过多年的临床实践总结的治疗PD的经验方。本课题组前期多项研究表明，本方可有效改善PD患者运动及非运动症状，改善患者睡眠情况，提高患者的生活质量，具有良好的临床疗效[9-11]。课题组前期动物实验结果表明水木和宁方可能通过调节UPP功能，促进α-syn的降解，从而改善PD小鼠的运动功能[12]。本研究拟在前期工作基础上，从细胞层面构建PD体外细胞模型，选择与UPP通路相关的指标，采用Real-time PCR法和Western blotting法进行探究，进一步验证水木和宁方调控蛋白降解通路，保护多巴胺（dopaminer,DA）能神经元的作用机制。

1 材料

1.1 实验细胞 PC12细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物与试剂 水木和宁方配方颗粒（江阴天江药业有限公司，批号：21051561），由熟地黄10 g，山茱萸6 g，黄精10 g，牛膝10 g，当归10 g，桃仁10 g，红花6 g，茯苓10 g，白术10 g，地龙10 g等药物组成[10]；美多芭（上海罗氏，批号：SH5198），以上药物均购自山东中医药大学附属医院。N-甲基-4-苯基吡啶鎓碘化物（MPP+iodide）（美国西格玛公司，批号：D048）；MTT试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：M8180）；胎牛血清（Lonsera，批号：OB08933）；RPMI 1640培养基（美国康宁公司，批号：BIO10040CV）；BCA试剂盒（批号：P0012S）、ECL化学发光液（批号：P0018S）、SDS-PAGE试剂盒（批号：P0690）均购自上海碧云天技术有限公司；TH抗体（批号：ab112）、UCH-L1抗体（批号：ab8189）、ubiquitin抗体（批号：ab7780）、Parkin抗体（批号：ab77924）、α-syn抗体（批号：ab52168）、UBE1抗体（批号：ab181225）均购自Abcam公司；beta-actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：20536-1-AP）；HRP标记山羊抗兔IgG二抗（批号：7074）、HRP标记山羊抗鼠IgG二抗（批号：7076）均购自CST公司；RNA快速提取试剂盒（思科捷生物，批号：AC0202）；反转录试剂预混液试剂盒（批号：AG11706）、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（批号：AG11701）、PCR引物均购自艾科瑞生物。

1.3 主要仪器 Multiskan Go1510型酶标仪、NanoDrop2000型微量紫外可见分光光度计（赛默飞世尔科技公司）；Light Cycler 480 Ⅱ型实时荧光定量PCR仪（美国罗氏集团）；Mini-Protean Tetra电泳系统、转膜仪（美国伯乐公司）；Fluor Chem Q成像和分析系统（美国Protein simple公司）；Axiovert 40型倒置相差显微镜（德国卡尔蔡司）。

2 方法

2.1 水木和宁方的配制 在传统煎煮方法的基础上，参考现代离体实验中药提取方法[13]。计算水木和宁方颗粒各味中药总和为300 g，将中药溶解于180 mL高压灭菌的ddH2O中，使用水浴锅进行加热，最终配制成质量浓度为2 g/mL的中药母液。将中药母液分装后，以5 000 r/min离心10 min，经过多次离心后，取上清液，0.22 μm滤膜进行过滤除菌，分装避光储存于-80 ℃冰箱中，现取现用。

2.2 细胞培养 细胞复苏后，培养于RPMI 1640培养液中（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL链霉素），37 ℃、5% CO2饱和湿度下进行培养，隔日更换1次培养液，待细胞生长融合至80%以上时，消化传代，选用对数生长期细胞进行后续实验。

2.3 PD体外细胞模型建立 MPP+不仅能够损害DA能神经元，产生PD样症状，还能在体外实验中诱导α-syn的过表达和聚集，因此本实验选用MPP+诱导PD模型[14-15]。实验设6个复孔，每孔100 μL，设置空白对照组、对照组、实验组（MPP+）。实验组分为0.25、0.5、1、2 mmol/L共4个浓度，空白对照组和对照组弃原液，加入1640基础培养基，采用MTT法筛选MPP+的最佳浓度。选用MPP+最佳浓度作用于细胞，孵育24 h，观察造模情况。

2.4 水木和宁方和美多芭药物最佳浓度筛选 筛选水木和宁方最佳浓度时，分为空白对照组、对照组、实验组（水木和宁方）。实验组分为0.5、1、2、4、6、8、10、12 mg/mL共8个质量浓度，空白对照组和对照组弃原液，加入1640基础培养基，采用MTT法筛选最佳浓度。美多芭药物最佳浓度的筛选方法同水木和宁方，药物质量浓度分别设置为25、12.5、6.25、3.125 l、1.5625μg/mL。

2.5 细胞分组及处理 实验分为对照组、模型组、水木和宁方组、美多芭组，干预一定时间后，收取细胞上清，冻存于-80 ℃冰箱，以备后续进行Real-time PCR和Western blotting检测。

2.6 水木和宁方对MPP+诱导的PC12细胞形态学影响 细胞干预结束后，将细胞培养瓶放置于倒置显微镜下观察，详细记录各组细胞形态学改变，并拍照分析。

2.7 水木和宁方对MPP+诱导的PC12细胞存活率的影响 采用MTT法检测细胞存活率，将细胞稀释成浓度为1×105个／mL的悬液，每孔取100 μL接种于96孔培养板中。培养24 h后，根据实验分组的不同进行干预，每孔设置6个复孔，药物干预24 h后加入200 μL MTT溶液（5 mg/mL）。继续培养4 h后弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min后，酶标仪490 nm处测定吸光度值，并计算细胞存活率。

2.8 Real-time PCR法检测泛素化相关分子mRNA表达水平 根据试剂盒说明提取总RNA，测定RNA浓度。通过反转录试剂盒将mRNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，GAPDH为内参，使用PCR仪进行扩增和检测。PCR扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火60 s，共40个循环；溶解曲线95 ℃5 s，65 ℃60 s；降温50 ℃30 s。每个实验指标重复检测3次取其平均值，计算采用2-ΔΔCt法进行分析。引物序列见表1。

表1 α-syn、TH、泛素化相关基因引物序列

2.9 Western blotting法检测泛素化相关蛋白的表达 采用RIPA裂解液裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清收集总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。取适量蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳，转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，4 ℃一抗（β-actin 1∶5 000，Ubiquitin 1∶1 000，α-syn 1∶500，UCH-L1 1∶400，Parkin 1∶400，TH 1∶400，E1 1∶1 000）孵育过夜。次日TBST洗膜15 min×3次，加入二抗（羊抗兔1∶5 000，羊抗小鼠1∶5 000）室温孵育1 h，TBST洗膜15 min×3次。最后通过化学发光剂ECL显色曝光，采用Image J软件分析条带灰度值。

2.10 统计学方法 采用IBM SPSS 26.0进行统计学处理，计量资料以“均数±标准差”（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 MPP+最佳造模浓度筛选 随着MPP+浓度的升高，OD值逐渐下降，MPP+浓度为0、0.25、0.5、1、2 mmol/L时，OD值分别为1.233±0.012、1.116±0.008、0.867±0.018、0.660±0.011、0.403±0.014，细胞存活率依次为为100.00%、92.46%、70.29%、53.53%、37.71%，差异有统计学意义（P＜0.05）。当1 mmol/L MPP+作用于PC12细胞时，细胞存活率为53.53%，接近于IC50值，对细胞的影响差异有统计学意义（P＜0.05），故本实验选择1 mmol/L作为MPP+最佳造模浓度。（见图1）

图1 MPP+对PC12 细胞存活率的影响（，n=3）

3.2 水木和宁方和美多芭药物最佳浓度选择 随着水木和宁方浓度的升高，PC12细胞的活力呈下降趋势，当水木和宁方质量浓度大于6 mg/mL时，细胞存活率明显降低（P＜0.05），故选择6 mg/mL作为水木和宁方最佳干预浓度。随着美多芭浓度的升高，细胞存活率呈下降趋势，当美多芭质量浓度大于3.125 μg/mL，细胞存活率明显降低（P＜0.05），因此本实验选择3.125 μg/mL作为美多芭最佳干预浓度。（见图2）

图2 水木和宁方和美多芭对PC12 细胞存活率的影响（，n=3）

3.3 各组PC12细胞存活率比较 与对照组比较，模型组PC12细胞存活率明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，水木和宁方组和美多芭组PC12细胞存活率明显升高（P＜0.05），且水木和宁方组PC12细胞存活率明显高于美多芭组（P＜0.05），进一步说明水木和宁方和美多芭对MPP+诱导的PC12细胞具有保护作用，能够提高PC12细胞存活率，且水木和宁方对细胞保护作用优于美多芭。（见图3）

图3 各组PC12 细胞存活率比较（，n=3）

3.4 各组PC12细胞形态学比较 对照组PC12细胞呈长梭形或者多角形贴壁生长，折光性能良好，有类似神经细胞的突起；模型组PC12细胞呈圆形，折光性变差，间隙变大，悬浮细胞数目增多，突触数目减少；水木和宁方组和美多芭组PC12细胞的形态、折光性、细胞间隙、突触数目均优于模型组，由此可见水木和宁方和美多芭对MPP+诱导的PC12细胞的损伤具有一定保护作用。（见图4）

图4 各组PC12 细胞形态学比较（×10）

3.5 各组PC12细胞α-syn、TH、泛素化相关分子mRNA表达水平比较 与对照组比较，模型组PC12细胞α-syn mRNA表达明显上调（P＜0.05），TH mRNA、UBE1 mRNA、Parkin mRNA、UCH-L1 mRNA、ubiquitin mRNA表达均明显下调（P＜0.05）；与模型组比较，水木和宁方组和美多芭组PC12细胞α-syn mRNA表达均明显下调（P＜0.05），TH mRNA、UBE1 mRNA、Parkin mRNA、UCH-L1 mRNA、ubiquitin mRNA表达均明显上调（P＜0.05）；与美多芭组比较，水木和宁方组PC12细胞α-syn mRNA表达均明显下调（P＜0.05），TH mRNA、UCH-L1 mRNA、ubiquitin mRNA表达均明显上调（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组PC12 细胞α-syn、TH、泛素化相关分子mRNA表达水平比较（，n=3）

表2 各组PC12 细胞α-syn、TH、泛素化相关分子mRNA表达水平比较（，n=3）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与美多芭组比较，cP＜0.05

3.6 各组PC12细胞α-syn、TH、泛素化相关蛋白表达比较 与对照组比较，模型组PC12细胞α-syn蛋白表达明显上调（P＜0.05），TH、UBE1、Parkin、UCH-L1、ubiquitin蛋白表达均明显下调（P＜0.05）；与模型组比较，水木和宁方组和美多芭组PC12细胞α-syn蛋白表达均明显下调（P＜0.05），TH、UBE1、Parkin、UCH-L1、ubiquitin蛋白表达均明显上调（P＜0.05）；与美多芭组比较，水木和宁方组PC12细胞α-syn蛋白明显下调（P＜0.05），TH、UCH-L1、ubiquitin蛋白表达均明显上调（P＜0.05）。（见图5、表3）

图5 各组PC12 细胞α-syn、TH、泛素化相关蛋白表达Westem blotting图

表3 各组PC12 细胞α-syn、TH、泛素化相关蛋白表达比较（，n=3）

表3 各组PC12 细胞α-syn、TH、泛素化相关蛋白表达比较（，n=3）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与美多芭组比较，cP＜0.05

4 讨论

UPP是体内重要的蛋白质降解途径，是保护细胞免受错误折叠蛋白质毒性作用的重要的机制之一，多项研究结果表明UPP与神经退行性疾病密切相关[16]。UPP通过泛素、泛素相关酶、蛋白酶体等调控特定蛋白的降解，调节细胞周期、免疫及炎症反应、细胞凋亡等[17]。氧化应激、内质网应激、细胞老化可导致蛋白错误折叠，导致损害蛋白的积聚。当损害蛋白异常聚集超过了UPP的降解能力时，可导致泛素化损害蛋白的积聚，进而影响神经元功能障碍甚至死亡[18-19]。越来越多的遗传、病理和实验证据表明，家族性和散发性帕金森病的神经变性可能与UPP清除蛋白质缺陷有关，导致蛋白质积累、聚集和细胞毒性[20]。

UPP在PD的发生发展过程中扮演着重要的角色，尤其是清除Lewy小体内积聚的α-syn、Parkin蛋白等。研究发现α-syn、Parkin和UCH-L1是3种与UPP功能障碍密切相关的突变基因[21]。其中α-syn是UPP主要底物蛋白，大量聚集会导致线粒体损伤诱发细胞凋亡[22]。在氧化应激、环境毒性损害或老化等外部因素作用下，α-syn的异常积聚通过刺激免疫反应、影响自噬、破坏DA的存储与释放等，最终导致DA能神经元细胞凋亡。UCH-L1具有泛素水解酶、连接酶活性，能维持泛素单体稳定，对神经元具有抗氧化保护作用。研究发现，UCH-L1与α-syn共聚集，其家族突变与帕金森病和其他神经退行性疾病相关[23]。UCH-L1的某些翻译后修饰可能促进细胞质的UCH-L1（C）转变为膜相关的UCH-L1（M）形式，在α-突触核蛋白病的形成中发挥了作用[24]。Parkin作为E3泛素连接酶，能参与细胞周期调控、线粒体动态平衡和能量代谢，调节泛素化过程及细胞自噬，在蛋白质分解代谢中发挥着重要作用，这些或许都作为Parkin预防PD的基础[25]。研究表明，TH是催化生物体自身合成左旋多巴胺系列反应中第一步反应的限速酶，在DA合成中发挥重要作用，其含量变化与PD的发生、发展有着重要联系[26]。

本研究从细胞层面验证水木和宁方通过调节UPP功能对PD的影响，并采用MPP+诱导PD体外细胞模型。本研究发现造模后UPP功能异常，TH、UB、UBE1、Parkin和UCH-L1蛋白和mRNA表达明显降低，α-Syn蛋白和mRNA表达明显升高，考虑可能是MPP+抑制了UPP中蛋白酶体的功能，抑制了蛋白降解通路。水木和宁方干预后，TH、UB、UBE1、Parkin和UCH-L1蛋白表达明显升高，α-Syn蛋白表达明显降低，提示水木和宁方可促进蛋白质降解，改善UPP功能。与美多芭组比较，水木和宁方组α-syn蛋白明显降低，TH、UCH-L1、ubiquitin蛋白表达明显升高。本实验结果与本课题组前期动物实验结果一致，由此可见水木和宁方可以通过调控UPP功能，抑制α-Syn蛋白的聚集，从而促进蛋白质的降解，具有良好的保护DA能神经元的作用。

水木和宁方由生地黄、肉苁蓉、狗脊、麦冬等31味药物组成[10]。研究表明生地黄主要是通过豆甾醇作用于MAOA、ADRA1B、ADRA1A等靶点，从多个途径发挥治疗帕金森病的作用[27]。现代药理研究也表明方中多种成分，如肉苁蓉多糖、远志皂苷、牛膝多肽等可以抑制神经元凋亡，抗氧化应激损伤，具有保护多巴胺能神经元的作用[28-31]。鉴于帕金森病发病时间长，“久病入络，久病及肾”及结合自身临床经验，霍青提出了帕金森病以“肝肾亏虚为本，痰浊瘀血为发病之标”的发病机制，并制定了滋补肝肾、活血通络、祛瘀化痰的治疗方法，同时应治标与治本相结合，灵活应用，充分发挥中医药多靶点、整体调节优势。本研究在前期动物实验的基础上，从细胞层面证实水木和宁方能通过提高UPP活性，清除异常蛋白，促进蛋白质降解，从而减轻DA能神经元细胞损伤，为水木和宁方治疗PD提供了理论依据和实验支持，也为PD中西医结合治疗提供了新思路。