HPLC法同时测定维C银翘片中8种成分的含量

庞文娟，王丽，张生杰

（武威市药品检验检测中心，甘肃 武威 733000）

维C银翘片作为中西药结合的代表药品，既有中医的治疗特点，又有西药退热镇痛功效。临床上维C银翘片用于治疗流感引起的发热、头痛、咳嗽、口干和喉咙痛[1-2]。经查询国家药品监督管理局数据库，维C银翘片作为中药制剂已有批准文号306个，同时维C银翘片也是一种治疗上呼吸道感染非处方药品，患者可以根据症状自行购买使用。但是据国家药品不良反应监测数据显示该品种存在一定的安全风险，虽然引起不良反应的原因是已知化学成分的不良反应，但是患者往往忽略了所添加的化学药物，造成重复用药而带来新的安全风险[3]。此外，生产维C银翘片的企业有上百家，每个厂家由于工艺、原辅料的差异使所生产的药品在质量、临床疗效方面都存在很大差异。现行维C银翘片质量标准仅对马来酸氯苯那敏、对乙酰氨基酚、维生素C、绿原酸、牛蒡子苷的含量进行了控制[4]，缺少对连翘和甘草的质量控制。这就造成很难用质量标准来有效的控制维C银翘片质量。因此，建立能够同时控制多个指标的方法对维C银翘片质量进行控制，以保证药品质量的稳定、安全，确保疗效并降低用药风险具有重要意义。目前已有文献报道同时测定维C银翘片多个成分含量的方法，普遍是选择维生素C、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、牛蒡子苷这7种成分中的3种或4种进行同时测定的研究[5-8]，此外，也有研究利用多波长检测技术或液质连用技术实现5～6种成分的同时测定[9-12]。本研究采用高效液相色谱法在同一个色谱条件下测定维C银翘片中8种指标成分的含量，为通过提高维C银翘片质量标准来控制原药材质量，确保质量稳定和疗效，提供了新的分析方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20AD高效液相色谱，配DAD检测器（日本岛津）；Secura125-1CED型十万之一电子天平（赛多利斯公司）；UA10MFD型超声波清洗器（德国wiggens公司）。

1.2 材料 甘草酸铵对照品（批号：110731-201/619，含量：93.1%）、绿原酸对照品（批号：110753-200112，含量：100%）、连翘酯苷A对照品（批号：111810-201606，含量：93.4%）、甘草苷对照品（批号：11052-201611，含量：95.0%）、马来酸氯苯那敏对照品（批号：100047-200606，含量：99.7%）、连翘苷对照品（批号：110821-201615，含量：94.9%）、牛蒡苷对照品（批号：110819-201007，含量：95.4%）、对乙酰氨基酚对照品（批号：100018-200408，含量：100%）均购自中国食品药品检定研究院；维C银翘片（A厂家，批号：202006020，C20 201120；B厂家，批号：201101；C厂家，批号：20 200803；D厂家，批号：20200601）；乙腈（色谱级）（美国默克公司，批号：10945730812）；甲酸（色谱级）（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10332080）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脱时间程序：0～10.0 min，90%B；10.0～20.0 min，90%～80%B；20.0～30.0 min，80%B～70%B；30.0～45.0 min，70%B～80%B；45.0～55.0 min，80%B～90%B；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：275 nm；进样量：20 μL。

BNP属于多肽类激素一种，是心血管系统的一种具有生物活性的重要激素，能在心肌受损时快速入血进行调节，能够灵敏的反映出心肌受损的情况［6］，并且与心肌受损程度正相关，心肌损伤越严重BNP水平越高，它是一种常用且有效的心衰检测指标。目前BNP已被纳入心衰诊断指南，用于心衰患者的预测和诊断工作。本研究中，钩藤人参高剂量组BNP水平与卡托普利组BNP水平相近，并明显低于模型组，说明钩藤人参高剂量组在降低HCHF大鼠BNP水平，改善心功能方面效果显著。

2.5 精密度试验 在所建色谱条件下，混合对照品溶液重复进样6次，得到各待测组分峰面积，计算对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、马来酸氯苯那敏、连翘苷、牛蒡苷、甘草酸铵峰面积RSD值分别为0.06%、0.05%、0.20%、0.04%、0.45%、0.58%、0.51%、1.35%，表明所使用高效液相色谱仪精密度良好。

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、马来酸氯苯那敏、连翘苷、牛蒡苷、甘草酸铵、对乙酰氨基酚对照品适量，用50%甲醇配成含对乙酰氨基酚（4 662 μg/mL）、绿原酸（222.5 μg/mL）、牛蒡苷（225.1 μg/mL）、马来酸氯苯那 敏（135.73 μg/mL）、连翘酯苷A（60.12 μg/mL）、甘草苷（51.64 μg/mL）、甘草酸铵（87.48 μg/mL）、连翘苷（48.55 μg/mL）8种对照品的混合对照品溶液。

2.6 稳定性试验 取维C银翘片（批号：201101），平行制备6份供试品，按“2.1”项下色谱条件，考察24 h内样品稳定性，每隔4 h取样检测1次，记录待测成分峰面积，计算峰面积RSD值。乙酰氨基酚、绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、马来酸氯苯那敏、连翘苷、牛蒡苷、甘草酸铵峰面积RSD值分别为0.15%、0.62%、0.88%、0.59%、0.91%、0.62%、0.28%、0.68%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，去除包衣，精密称取细粉约0.20 g，置于棕色容量瓶中，精密加50%甲醇20 mL，称质量，超声（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再称质量，用50%甲醇补足质量，过滤，取续滤液，即可。

2.9 含量测定 取5批维C银翘片样品，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，外标法计算样品含量，结果见表3。

证明：假设(x(t),y(t),u(t),v(t))T为系统(1.1)的解，由系统(1.1)的第一个方程得，则由引理2.1的结果，易知

表1 8 种化学成分的线性关系、定量限和检出限

2.2 溶液的制备

2.4 线性关系、定量限和检出限考察 将混合对照品溶液逐步稀释6、5、3、2倍，与混合对照品组成毓浓度梯度，按“2.1”项下色谱条件测定，以进样量（μg）为横坐标（x），峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归分析，求得回归方程、相关系数（r）和线性范围；通过连续稀释混合对照溶液确定定量限和检测限，当信号和噪声之间的比值为3时所对应的浓度确定为检测限，信号和噪声之间的比值为10时所对应的浓度确定为定量限[13]，结果见表1。

她从头到尾见证了他们被屠杀的过程。人的残忍真是没有极限，没有止境。天下是没有公理的，否则一群人怎么跑到别人的国家如此撒野?把别人国家的人如此欺负?她哭还因为自己国家的人就这样软弱，从来都是受人欺负。书娟哭得那个痛啊，把冲天冤屈都要哭出来。

2.8 加样回收率试验 精密称取每份约0.10 g已知含量的维C银翘片（批号：201101）6份，加入与待测组分含量相当的对照溶液，按建立的色谱条件进行分析，用回归方程计算相应含量，并计算待测组分的平均加样回收率和RSD值。结果表明，8种待测组分的加样平均回收率在95.82%～101.08%之间，RSD＜2.0%，表明所建HPLC色谱方法的准确度良好。（见表2）

2.7 重复性试验 取维C银翘片（批号：201101）样品细粉6份，按供试品溶液制备方法平行制备，按所建立的色谱条件进行分析，计算待测成分含量。乙酰氨基酚、绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、马来酸氯苯那敏、连翘苷、牛蒡苷、甘草酸铵含量RSD值分别为0.48%、0.57%、0.74%、1.28%、1.30%、1.55%、0.75%、0.78，表明所建方法重复性良好。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

2.3 专属性试验 按“2.1”项下色谱条件，分别进样20 μL混合对照品溶液和供试品溶液进行专属性分析。测定结果表明，混合对照品8种待测成分，在供试品溶液保留时间（±0.5%）处都有特征峰，分离度、拖尾因子理论塔板数均满足定量分析要求，其他成分峰对待测成分无干扰。（见图1）

表3 维C 银翘片样品测定结果（mg/g）

3 讨 论

3.1 待测成分的选择 维C银翘片是在经典名方银翘散基础上添加西药组成的中西药复方制剂。在银翘散方剂中金银花、连翘发挥主要疗效，相须配伍使用同为君药，故本研究选择用绿原酸、连翘脂苷A、连翘苷3个指标成分控制其质量。市场销售连翘饮片质量分析发现连翘分为青翘、老翘，其连翘脂苷A与连翘苷存在明显差异，用连翘脂苷A、连翘苷两种成分同时控制连翘质量更为全面[14-15]。牛蒡苷为牛蒡子的指标成分，能够直接反映牛蒡子质量状况，且不同产地牛蒡子中牛蒡苷含量有差异[16]。现代药理研究发现甘草苷、甘草酸铵具有明显的糖皮质激素样作用[17]，甘草苷和甘草酸铵最大的副作用是由高血压和低钾血症引起的继发性疾病[18]，故应控制维C银翘片中甘草的质量以保障疗效的稳定。维C银翘片不良反应主要是由对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏引起的，对其含量控制是保障维C银翘片安全性的重要质控指标[3]。综上选择用上述8种成分能够更好地控制维C银翘片质量，以减少用药风险。

周泽赡霍地一下睁开了眼，门外小鸡叫声已没先前那么大了。周泽赡把被子掀开，猛地坐起，衣服也不穿就跑了出去。

3.2 优化色谱条件 本研究对确定的8种待测成分在190～700 nm内进行全波长扫描，同时考虑8种成分在维C银翘片中含量在同一色谱条件下的响应值，为确保各成分峰面积能够同时满足定量需求，故确定检测波长为275 nm。在此波长下待测成分均具有良好的吸收，在供试品色谱中各成分色谱峰能够实现较好的分离，且能够满足在同一色谱条件下定量分析的系统适用性。因待测成分极性差异较大，为实现8种成分同时测定，需选用梯度洗脱。此外，本研究还考察了不同流动相组成对峰形的影响，试验证明加入0.1%甲酸时峰形最好，并对梯度洗脱时间程序进行优化已实现良好的分离效果。“2.1”项下色谱条件能够在35 min内实现8种待测成分的同时定量分析。

我打算说点什么，想向他保证，我可以撑下去，也许吧——，但话到嘴边又咽了回去，不知为什么。可能因为我不想再看到艾瑞克那张脸，也不喜欢他盯着我，甚至永远不想让他再看我。

3.3 维C银翘片质量分析 本研究通过测定维C银翘片中8种成分的含量发现，不同厂家生产的维C银翘片和同一厂家生产的维C银翘片8种成分含量存在明显的差异，尤其是《中华人民共和国药典》标准中未列出的质控成分差别更明显，比如连翘苷A的最高含量是最低含量的两倍多，甘草酸差别竟高达3倍。这可能为市场上销售的维C银翘片质量和疗效参差不齐的原因，因此增加维C银翘片质量控制成分，对其安全性和保证疗效尤为重要。本试验因缺少足够的样品并未对市售维C银翘片的质量进行系统的评价分析，建议市场监督部门加大对维C银翘片监督抽验，同时应提高维C银翘片质量标准以确保安全性和疗效。本分析方法不足之处在于未将维生素C纳入此分析方法中进行多成分同时测定。维生素C特殊的化学性质，使其在该色谱条件下出峰较早，容易与溶剂峰混淆很难进行定量分析，故本分析方法未能实现同时测定。维生素C常作为抗氧化剂以预防或治疗坏血病，超剂量服用可能会导致胃肠道不适、头痛、失眠等不良反应，且目前尚无具体研究证明其能预防或治疗感冒[19]，因此在以后的分析研究中应加以关注。