响应面法优化酶辅助超声提取蓝莓花青素工艺研究

马全民， 刘王梅， 聂复礼， 张尧， 汪娟

(1.浙江惠松制药有限公司，浙江 杭州 310000； 2.浙江科技学院 生物与化学工程学院，浙江 杭州 310023)

蓝莓是一种甜味多汁、营养健康的深蓝色浆果，具有抗氧化、抗癌、保护肝脏、调节肠道菌群、缓解视觉疲劳等多种功效，是世界粮农组织推荐的5种健康水果之一，被誉为“水果皇后”[1-2]。蓝莓富含酚酸、木质素、单宁等酚类化合物和花青素、黄烷醇等黄酮类化合物，其中花青素含量在所有水果和蔬菜中最高[3]。花青素是一种广泛存在于植物中的天然色素，由牵牛花色素、锦葵色素、飞燕草色素、矢车菊色素、芍药色素等花青素苷元及这些苷元与乙酰阿拉伯糖、半乳糖、乙酰葡萄糖、葡萄糖、阿拉伯糖连接所形成的花青素糖苷组成[4]。花青素因其具有清除自由基、抗氧化应激、抗炎症、抗辐射、保护视网膜、降低血脂、抗衰老和改善肠道健康等多种功能而备受关注[5]。将蓝莓中花青素提取出来作为膳食补充剂，不仅可以充分利用其生理功能，而且可以解决蓝莓不耐贮藏、易腐烂等问题，提高蓝莓的商品价值。因此，蓝莓花青素的提取和制备工艺受到研究人员的关注。

超声辅助提取法是利用超声波振动带来的空化效应，强大的压力使植物细胞壁瞬间破裂，从而促进胞内活性物的溶出[6]。超声和酶的联合使用结合了超声提取和酶法提取的优点，提取时间短、效率高，且能保持提取物的活性，已被广泛用于提取活性物质[7]。本研究以蓝莓为对象，采用Plackett-Burman(筛选试验)设计法、最陡爬坡路径法和Box-Behnken(盒状试验)设计中的响应面分析法，对酶辅助超声提取蓝莓花青素工艺参数进行优化。

1 材料与方法

1.1 供试材料

蓝莓原料购自本地农贸市场，-20 ℃冷冻保存。果胶酶和纤维素酶购自南宁庞博生物工程有限公司。矢车菊素-3-O-葡萄糖购自上海百灵威，其他试剂购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

仪器与设备：榨汁机，九阳股份有限公司出品；BAS224S电子天平和PB-10精密pH计，德国Sartorius出品；Primor高速离心机和MK3酶标仪，赛默飞世尔仪器有限公司出品；FreeZone2.5L冷冻干燥仪，美国Labconco出品。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验

蓝莓用榨汁机打浆，分别精确称取蓝莓果浆10 g于烧杯中，采用超声法，以酸水溶液为溶剂，分别考察酶种类(果胶酶、纤维素酶、混合酶、无酶)，超声温度(20、30、40、50、60 ℃)，酶量(0.33、0.67、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg·g-1)，超声时间(5、10、15、20、25 min)，料液比(0.20、0.25、0.33、0.50、1.00 g·mL-1)，pH(0.3、0.5、0.7、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)等对花青素提取的影响，加入无水乙醇至相应的乙醇体积分数(30%、40%、50%、60%、70%)，继续超声搅拌10 min，提取液在4 500 r·min-1条件下离心10 min。过滤，滤液定容到50 mL，通过pH示差法测定花青素含量。

1.2.2 响应面优化

在单因素试验基础上，通过Minitab软件的显著因素筛选，按照3因素3水平进行Box-Behnken中心试验设计。

1.2.3 花青素含量测定

以矢车菊素-3-O-葡萄糖为标准品，通过pH示差法测定花青素含量[8]。

2 结果与分析

2.1 单因素影响

2.1.1 酶种类

花青素主要存在于蓝莓果皮之中，简单的溶剂提取很难将花青素完全提取出来，而酶会降解蓝莓果皮的细胞壁，使细胞中的花青素成分迅速扩散到溶液中, 从而有效提高蓝莓花青素的提取率[9]。图1显示，与无酶处理相比，酶解法明显提高了花青素的含量，其中，果胶酶效果最好，纤维素酶次之，混合酶(果胶酶∶纤维素酶1∶1)效果最差。

混合酶为果胶酶∶纤维素酶1∶1。

2.1.2 酶量

以果胶酶进行蓝莓花青素提取，研究酶量对花青素含量的影响，结果如图2所示。从图中可知，花青素含量呈现出先增后降的变化趋势，因此，选择3.00 mg·g-1的酶量进行下一步试验。

图2 酶量对蓝莓花青素含量的影响

2.1.3 超声温度

超声温度对花青素稳定性、提取率及果胶酶活性都有影响。本研究考察了不同温度对蓝莓花青素含量的影响(图3)，结果表明，蓝莓花青素的含量随温度的降低而增加，说明在酶解和超声辅助提取时，20 ℃即可有效提取花青素。研究[6,10]表明，长时间处在热溶剂中，容易造成花青素等活性成分降解和生理活性降低，超声波辅助提取实现了低温条件下活性物的提取，是一种非常有效的提取方法。

图3 超声温度对蓝莓花青素含量的影响

2.1.4 料液比

考察了料液比对蓝莓花青素含量的影响，结果如图4所示。随着料液比降低，花青素含量呈现出先增后降的趋势，料液比0.50 g·mL-1时含量最高。

图4 料液比对蓝莓花青素含量的影响

2.1.5 超声时间

在超声过程中，超声波会产生一定的空化效应和热效应，使细胞壁更快破碎，加快花青素的释放和溶解，从而提高花青素的提取率。但如果提取时间过长，花青素的结构也会发生一定程度的变化，导致提取率降低[11]。本研究考察了超声提取时间对蓝莓花青素含量的影响(图5)，随着超声时间的增加，蓝莓花青素的含量逐渐降低，这可能是因为当超声时间过长时，花青素的结构因为超声而发生改变，从而降低了花青素含量。超声提取时间5 min时含量最高。

图5 超声时间对蓝莓花青素含量的影响

2.1.6 pH

花青素在中性和弱碱性溶液中不稳定，在pH大于6的碱性环境中易降解，生成活性较低的酚类和醛类，而在酸性条件下稳定性较好[12]。同时，酸性溶剂能破坏植物细胞膜，使水溶性色素更好地溶解，有利于花青素的提取。图6结果表明，随着pH的增加，蓝莓花青素含量呈先升高后降低的趋势，在pH 0.5时蓝莓花青素含量达最高点，因此，以pH 0.5进行后续试验。

图6 pH对蓝莓花青素含量的影响

2.1.7 乙醇体积分数

蓝莓花青素是水溶性黄酮，常用的提取溶剂为酸化乙醇、甲醇、丙酮等强极性溶剂或它们的混合溶剂[13]。图7表明，随着乙醇体积分数的提高，蓝莓花青素含量呈先升高后降低的趋势，含量最高点在乙醇体积分数50%处，此后随着乙醇体积分数增加，花青素提取率逐渐降低，因此，以乙醇体积分数50%进行后续试验。

图7 乙醇体积分数对蓝莓花青素含量的影响

2.2 响应面优化

2.2.1 Plackett-Burman设计确定显著影响因素

根据单因素试验确定蓝莓花青素提取的初步条件：使用果胶酶，pH(A因素)0.5，超声温度(B因素)20 ℃，超声时间(C因素)5 min，乙醇体积分数(D因素)50%，料液比(E因素)0.5 g·mL-1，酶量(F因素)3.0 mg·g-1。为确定显著影响因素，选用12个处理组合的Plackett-Burman设计，来考察A、B、C、D、E、F因素-1、1水平对花青素含量的影响，结果如表1所示。

应用Minitab软件对表1数据进行分析、拟合，结果模型的F值为6.10，表明模型的拟合显著性好，具有统计学意义。根据各因素P值(表2)确定对蓝莓花青素提取率的显著影响因素为pH、料液比和酶量。

表1 Plackett-Burman试验设计及响应值

2.2.2 最陡爬坡试验确定因素水平

通过Plackett-Burman试验得出影响蓝莓花青素含量的显著因素后，需要通过响应面法优化提取工艺参数。根据表2中A、E、F因素的系数项效应可知，pH、料液比为负效应，在设计试验方案时应当依次减小；酶量为正效应，在设计试验方案时应当依次增大。最陡爬坡试验结果如表3所示，随着pH、料液比的不断减小和酶量的不断增加，蓝莓花青素含量呈先增大后减小的趋势。当pH为0.3，料液比0.3 g·mL-1，酶量为4.33 mg·g-1时，花青素含量达到最大值(0.506 mg·g-1)。因此，以处理组合8作为中心值进行后续的响应面试验。

表2 Plackett-Burman试验各因素效应

表3 最陡爬坡路径试验设计及响应值

2.2.3 响应面设计结果

通过最陡爬坡路径法确定3个显著影响因子之后，以pH为0.3，料液比为0.3 g·mL-1，酶量为4.33 mg·g-1作为试验中的中心点进行响应面设计，优化蓝莓花青素提取工艺。其中，Box-Behnken设计及结果见表4。

表4 Box-Behnken设计及响应值

应用Minitab软件对数据进行分析、拟合，结果二次模型多元相关性系数R2=97.14%，表明仅有2.86%的变异不能由此模型解释。回归模型的F值为26.45，表明模型的拟合显著性好，具有统计学意义。失拟因素的F值为0.31，表明失拟不显著，即可用该回归方程代替试验真实点，对试验结果进行分析。

对试验模型进行二阶回归模拟，得到回归方程：花青素含量=-4.584 81-2.125 39A+3.087 21F-5.490 75E+0.784 09AF-5.25AE+2.413 64FE-0.233 25A2-0.480 56F2-7.715 75E2。

此外，从回归方程的方差分析可以看出，料液比的一次项影响极显著(F=40.58**)，pH、酶量的一次项影响不显著。这表明料液比对花青素含量有较大影响；pH、酶量的变化对花青素含量也有影响，但相对料液比而言并不显著。模型的响应面图及其等高线图如图8所示。

图8 Box-Behnken设计蓝莓花青素提取的响应面

2.2.4 验证试验

由软件分析可知，pH 0.5、酶量4.13 mg·g-1、料液比0.15 g·mL-1时预测花青素含量最大，为0.578 mg·g-1。

为证实模型预测结果的可靠性，在该条件下进行重复试验，实际检测花青素含量为0.606 mg·g-1，与理论值相比，相对偏差为4.84%，重复试验结果说明，可利用回归方程对提取结果进行预测。

3 小结

本研究通过单因素试验，分析各因素对蓝莓花青素含量的影响；在此基础上，通过Plackett-Burman设计确定影响蓝莓花青素含量的3个显著因素(pH、料液比和酶量)，通过最陡爬坡试验得出3个因子的最大响应值区域；最后，通过Box-Behnken设计的响应面得出最优提取工艺：使用果胶酶，提取液pH 0.5，超声温度20 ℃，超声时间5 min，乙醇体积分数50%，料液比0.15 g·mL-1，酶量4.13 mg·g-1。

在最优提取工艺条件下，实际测得花青素含量为0.606 mg·g-1，优化结果与实际提取结果相对偏差为4.84%。