响应面法优化酶辅助超声提取蓝莓花青素工艺研究
2022-11-07马全民刘王梅聂复礼张尧汪娟
马全民, 刘王梅, 聂复礼, 张尧, 汪娟
(1.浙江惠松制药有限公司,浙江 杭州 310000; 2.浙江科技学院 生物与化学工程学院,浙江 杭州 310023)
蓝莓是一种甜味多汁、营养健康的深蓝色浆果,具有抗氧化、抗癌、保护肝脏、调节肠道菌群、缓解视觉疲劳等多种功效,是世界粮农组织推荐的5种健康水果之一,被誉为“水果皇后”[1-2]。蓝莓富含酚酸、木质素、单宁等酚类化合物和花青素、黄烷醇等黄酮类化合物,其中花青素含量在所有水果和蔬菜中最高[3]。花青素是一种广泛存在于植物中的天然色素,由牵牛花色素、锦葵色素、飞燕草色素、矢车菊色素、芍药色素等花青素苷元及这些苷元与乙酰阿拉伯糖、半乳糖、乙酰葡萄糖、葡萄糖、阿拉伯糖连接所形成的花青素糖苷组成[4]。花青素因其具有清除自由基、抗氧化应激、抗炎症、抗辐射、保护视网膜、降低血脂、抗衰老和改善肠道健康等多种功能而备受关注[5]。将蓝莓中花青素提取出来作为膳食补充剂,不仅可以充分利用其生理功能,而且可以解决蓝莓不耐贮藏、易腐烂等问题,提高蓝莓的商品价值。因此,蓝莓花青素的提取和制备工艺受到研究人员的关注。
超声辅助提取法是利用超声波振动带来的空化效应,强大的压力使植物细胞壁瞬间破裂,从而促进胞内活性物的溶出[6]。超声和酶的联合使用结合了超声提取和酶法提取的优点,提取时间短、效率高,且能保持提取物的活性,已被广泛用于提取活性物质[7]。本研究以蓝莓为对象,采用Plackett-Burman(筛选试验)设计法、最陡爬坡路径法和Box-Behnken(盒状试验)设计中的响应面分析法,对酶辅助超声提取蓝莓花青素工艺参数进行优化。
1 材料与方法
1.1 供试材料
蓝莓原料购自本地农贸市场,-20 ℃冷冻保存。果胶酶和纤维素酶购自南宁庞博生物工程有限公司。矢车菊素-3-O-葡萄糖购自上海百灵威,其他试剂购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
仪器与设备:榨汁机,九阳股份有限公司出品;BAS224S电子天平和PB-10精密pH计,德国Sartorius出品;Primor高速离心机和MK3酶标仪,赛默飞世尔仪器有限公司出品;FreeZone2.5L冷冻干燥仪,美国Labconco出品。
1.2 试验方法
1.2.1 单因素试验
蓝莓用榨汁机打浆,分别精确称取蓝莓果浆10 g于烧杯中,采用超声法,以酸水溶液为溶剂,分别考察酶种类(果胶酶、纤维素酶、混合酶、无酶),超声温度(20、30、40、50、60 ℃),酶量(0.33、0.67、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg·g-1),超声时间(5、10、15、20、25 min),料液比(0.20、0.25、0.33、0.50、1.00 g·mL-1),pH(0.3、0.5、0.7、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)等对花青素提取的影响,加入无水乙醇至相应的乙醇体积分数(30%、40%、50%、60%、70%),继续超声搅拌10 min,提取液在4 500 r·min-1条件下离心10 min。过滤,滤液定容到50 mL,通过pH示差法测定花青素含量。
1.2.2 响应面优化
在单因素试验基础上,通过Minitab软件的显著因素筛选,按照3因素3水平进行Box-Behnken中心试验设计。
1.2.3 花青素含量测定
以矢车菊素-3-O-葡萄糖为标准品,通过pH示差法测定花青素含量[8]。
2 结果与分析
2.1 单因素影响
2.1.1 酶种类
花青素主要存在于蓝莓果皮之中,简单的溶剂提取很难将花青素完全提取出来,而酶会降解蓝莓果皮的细胞壁,使细胞中的花青素成分迅速扩散到溶液中, 从而有效提高蓝莓花青素的提取率[9]。图1显示,与无酶处理相比,酶解法明显提高了花青素的含量,其中,果胶酶效果最好,纤维素酶次之,混合酶(果胶酶∶纤维素酶1∶1)效果最差。
混合酶为果胶酶∶纤维素酶1∶1。
2.1.2 酶量
以果胶酶进行蓝莓花青素提取,研究酶量对花青素含量的影响,结果如图2所示。从图中可知,花青素含量呈现出先增后降的变化趋势,因此,选择3.00 mg·g-1的酶量进行下一步试验。
图2 酶量对蓝莓花青素含量的影响
2.1.3 超声温度
超声温度对花青素稳定性、提取率及果胶酶活性都有影响。本研究考察了不同温度对蓝莓花青素含量的影响(图3),结果表明,蓝莓花青素的含量随温度的降低而增加,说明在酶解和超声辅助提取时,20 ℃即可有效提取花青素。研究[6,10]表明,长时间处在热溶剂中,容易造成花青素等活性成分降解和生理活性降低,超声波辅助提取实现了低温条件下活性物的提取,是一种非常有效的提取方法。
图3 超声温度对蓝莓花青素含量的影响
2.1.4 料液比
考察了料液比对蓝莓花青素含量的影响,结果如图4所示。随着料液比降低,花青素含量呈现出先增后降的趋势,料液比0.50 g·mL-1时含量最高。
图4 料液比对蓝莓花青素含量的影响
2.1.5 超声时间
在超声过程中,超声波会产生一定的空化效应和热效应,使细胞壁更快破碎,加快花青素的释放和溶解,从而提高花青素的提取率。但如果提取时间过长,花青素的结构也会发生一定程度的变化,导致提取率降低[11]。本研究考察了超声提取时间对蓝莓花青素含量的影响(图5),随着超声时间的增加,蓝莓花青素的含量逐渐降低,这可能是因为当超声时间过长时,花青素的结构因为超声而发生改变,从而降低了花青素含量。超声提取时间5 min时含量最高。
图5 超声时间对蓝莓花青素含量的影响
2.1.6 pH
花青素在中性和弱碱性溶液中不稳定,在pH大于6的碱性环境中易降解,生成活性较低的酚类和醛类,而在酸性条件下稳定性较好[12]。同时,酸性溶剂能破坏植物细胞膜,使水溶性色素更好地溶解,有利于花青素的提取。图6结果表明,随着pH的增加,蓝莓花青素含量呈先升高后降低的趋势,在pH 0.5时蓝莓花青素含量达最高点,因此,以pH 0.5进行后续试验。
图6 pH对蓝莓花青素含量的影响
2.1.7 乙醇体积分数
蓝莓花青素是水溶性黄酮,常用的提取溶剂为酸化乙醇、甲醇、丙酮等强极性溶剂或它们的混合溶剂[13]。图7表明,随着乙醇体积分数的提高,蓝莓花青素含量呈先升高后降低的趋势,含量最高点在乙醇体积分数50%处,此后随着乙醇体积分数增加,花青素提取率逐渐降低,因此,以乙醇体积分数50%进行后续试验。
图7 乙醇体积分数对蓝莓花青素含量的影响
2.2 响应面优化
2.2.1 Plackett-Burman设计确定显著影响因素
根据单因素试验确定蓝莓花青素提取的初步条件:使用果胶酶,pH(A因素)0.5,超声温度(B因素)20 ℃,超声时间(C因素)5 min,乙醇体积分数(D因素)50%,料液比(E因素)0.5 g·mL-1,酶量(F因素)3.0 mg·g-1。为确定显著影响因素,选用12个处理组合的Plackett-Burman设计,来考察A、B、C、D、E、F因素-1、1水平对花青素含量的影响,结果如表1所示。
应用Minitab软件对表1数据进行分析、拟合,结果模型的F值为6.10,表明模型的拟合显著性好,具有统计学意义。根据各因素P值(表2)确定对蓝莓花青素提取率的显著影响因素为pH、料液比和酶量。
表1 Plackett-Burman试验设计及响应值
2.2.2 最陡爬坡试验确定因素水平
通过Plackett-Burman试验得出影响蓝莓花青素含量的显著因素后,需要通过响应面法优化提取工艺参数。根据表2中A、E、F因素的系数项效应可知,pH、料液比为负效应,在设计试验方案时应当依次减小;酶量为正效应,在设计试验方案时应当依次增大。最陡爬坡试验结果如表3所示,随着pH、料液比的不断减小和酶量的不断增加,蓝莓花青素含量呈先增大后减小的趋势。当pH为0.3,料液比0.3 g·mL-1,酶量为4.33 mg·g-1时,花青素含量达到最大值(0.506 mg·g-1)。因此,以处理组合8作为中心值进行后续的响应面试验。
表2 Plackett-Burman试验各因素效应
表3 最陡爬坡路径试验设计及响应值
2.2.3 响应面设计结果
通过最陡爬坡路径法确定3个显著影响因子之后,以pH为0.3,料液比为0.3 g·mL-1,酶量为4.33 mg·g-1作为试验中的中心点进行响应面设计,优化蓝莓花青素提取工艺。其中,Box-Behnken设计及结果见表4。
表4 Box-Behnken设计及响应值
应用Minitab软件对数据进行分析、拟合,结果二次模型多元相关性系数R2=97.14%,表明仅有2.86%的变异不能由此模型解释。回归模型的F值为26.45,表明模型的拟合显著性好,具有统计学意义。失拟因素的F值为0.31,表明失拟不显著,即可用该回归方程代替试验真实点,对试验结果进行分析。
对试验模型进行二阶回归模拟,得到回归方程:花青素含量=-4.584 81-2.125 39A+3.087 21F-5.490 75E+0.784 09AF-5.25AE+2.413 64FE-0.233 25A2-0.480 56F2-7.715 75E2。
此外,从回归方程的方差分析可以看出,料液比的一次项影响极显著(F=40.58**),pH、酶量的一次项影响不显著。这表明料液比对花青素含量有较大影响;pH、酶量的变化对花青素含量也有影响,但相对料液比而言并不显著。模型的响应面图及其等高线图如图8所示。
图8 Box-Behnken设计蓝莓花青素提取的响应面
2.2.4 验证试验
由软件分析可知,pH 0.5、酶量4.13 mg·g-1、料液比0.15 g·mL-1时预测花青素含量最大,为0.578 mg·g-1。
为证实模型预测结果的可靠性,在该条件下进行重复试验,实际检测花青素含量为0.606 mg·g-1,与理论值相比,相对偏差为4.84%,重复试验结果说明,可利用回归方程对提取结果进行预测。
3 小结
本研究通过单因素试验,分析各因素对蓝莓花青素含量的影响;在此基础上,通过Plackett-Burman设计确定影响蓝莓花青素含量的3个显著因素(pH、料液比和酶量),通过最陡爬坡试验得出3个因子的最大响应值区域;最后,通过Box-Behnken设计的响应面得出最优提取工艺:使用果胶酶,提取液pH 0.5,超声温度20 ℃,超声时间5 min,乙醇体积分数50%,料液比0.15 g·mL-1,酶量4.13 mg·g-1。
在最优提取工艺条件下,实际测得花青素含量为0.606 mg·g-1,优化结果与实际提取结果相对偏差为4.84%。