鱼肥对葡萄果实品质及其游离氨基酸组分含量的影响

林媚， 何风杰， 徐小菊， 冯先桔， 王天玉， 姚周麟

(1.浙江省柑橘研究所，浙江 台州 318026； 2.台州市农业技术推广中心，浙江 台州 318000；3.温岭市农业农村和水利局，浙江 台州 317500)

葡萄为我国的主产水果之一，味美可口，营养丰富，深受消费者喜爱。2016年全国葡萄总产量达1 374.5×104t，较2000年增加4.2倍[1]。我国的葡萄品种丰富，以欧美葡萄(巨峰、夏黑等)和欧亚葡萄(红地球、无核白、玫瑰香、维多利亚等)占比最多，近几年，一些新品种(阳光玫瑰、金手指等)也获得大面积发展[2]。2018年浙江温岭葡萄种植面积达4 000 hm2，主栽品种为维多利亚，因该品种比较古老，同时生产过程中存在农户片面追求产量、栽培措施不到位等问题，导致葡萄品质下降，价格下滑，效益不佳。为改变现状，适应市场的需求，通过引种新品种晨香进行结构调整，以提高农民收益[3]。

果树生产过程中有机肥的应用较多，有机肥具有肥效长、补充土壤肥力等优点[4]。近年有关施用有机肥对葡萄产量和品质影响的相关研究较多[5-7]，合理施用有机肥有助于提高葡萄的产量和品质。目前生产上应用的有机肥来源广泛，种类很多，常用的有羊粪、猪粪、鸡粪、碳基生物肥、菜饼肥、生物菌肥、腐殖酸等，也有一些新型的有机复混肥在不断开发应用[8]。鱼肥是一种由菜饼肥、谷壳及鱼罐头深加工的固废物按一定比例配制后腐熟而成的有机肥，目前在台州沿海各地逐步推广应用，在改土提质上效果明显。

果实品质是决定市场竞争力的重要因素。关于葡萄的品质研究主要为单粒重、穗重、可溶性固形物、总酸和维生素等[9]，还有少数关于葡萄果实中氨基酸含量方面的研究报道[10-11]。氨基酸作为营养物质被人体吸收利用，是葡萄品质的重要组成部分，同时参与果实其他组分的形成及风味物质的合成[12]，其存在形式主要以游离态和结合态2种形式[13]。结合态氨基酸在食用过程中不能立即水解，对滋味影响不大；游离氨基酸是一类重要的味道活性成分[14-15]，可呈现各种独特的滋味，其含量会直接影响风味[16-18]。同时，果实中氨基酸的含量和种类对果实品质有重要影响，可作为评价果实品质的重要指标。因此，葡萄中的氨基酸特别是呈味氨基酸对果实的滋味具有重要贡献[19]。同时，葡萄中氨基酸的含量会受品种、气候、种植条件等因素的影响。因此，研究氨基酸组分含量对提高葡萄品质具有重要意义[20]。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以当地传统葡萄品种维多利亚和新引种的3年生贝达砧的晨香葡萄为供试品种。试验于2020年在温岭市陈菊莲家庭农场进行，亚热带季风气候，四季分明，气候温和，温湿适中，雨量充沛，光照适宜，无霜期约250 d。土壤pH 5.82，为自培土(土壤∶有机质∶有机物1∶1∶1)。采用钢架大棚、宽行起垄，H形架式种植，株行距为3.4 m×3.0 m，南北行向。采用双顶膜覆盖促早栽培，覆膜时间为2019年12月20日。

复合肥含N 15%、P2O515%、K2O 15%(湖北三宁化工)；鱼肥为温岭本地自产，以水产品深加工中无法收回的鱼肉等杂质为主要原料，与谷壳或蘑菇泥等生物质混合，在其中添加生物菌种，经过10 d左右的高温发酵而成。

仪器与试剂：RIGOL L3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技)；C18-H(250 mm×4.6 mm，5 μm；赛分Amethyst)；Thermo Micro CL 17R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技)；KQ2200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PAL-1数字手持折糖仪(日本爱拓公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；AR1502CN电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；旋涡混合器MS3(德国IKA公司)。

天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)和脯氨酸(Pro)共18种氨基酸标准品(Sigma，纯度≥99.9%)；HPLC级乙腈(J&K CHEMICAL LTD，纯度≥99.9%)；正亮氨酸，三乙胺(国药集团化学试剂有限公司，纯度≥99.0%，优级纯)；异硫氰酸苯酯(Sigma，纯度≥99.9%)；正己烷(国药集团化学试剂有限公司，纯度≥97.0%，优级纯)；无水乙酸钠(国药集团化学试剂有限公司，纯度≥99%，优级纯)；盐酸(国药集团化学试剂有限公司，36.0%～38.0%，优级纯)；冰醋酸(生工，纯度≥98%)。

1.2 处理设计

以正常施用的复合肥为对照(CK)，以增施当地生产的鱼肥为处理，对维多利亚和晨香成熟果实的品质指标及游离氨基酸各组分含量进行检测分析，再结合味道强度值(taste active value，TAV)分析各组分对风味的影响，最终对施肥前后葡萄果实各指标的变化进行综合评估。

1.3 检测项目与方法

1.3.1 理化品质指标

随机选取100粒果实用于测定果粒质量，以及可溶性固形物(TSS)和可滴定酸(TA)含量，重复3次。果粒质量采用电子天平测量；TSS含量用数显手持糖度计测量；TA含量使用酸碱滴定法测定；固酸比为TSS与TA的比值。

1.3.2 游离氨基酸

参考卫阳飞等[21]的方法，略作改进。随机称取葡萄样品约300 g，去除果皮和种子，将果肉匀浆，取适量果汁离心，取上清液200 μL，分别置于2 mL EP管中，每个离心管中准确加入正亮氨酸内标液20 μL；再依次向每个EP管中加入三乙胺乙腈溶液100 μL(确保pH>7)和异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混匀后于25 ℃下放置1 h，然后加入正己烷400 μL至每个EP管中，摇晃后放置10 min，取下层溶液，采用0.22 μm针式过滤器过滤后上机检测。

分离柱为赛分Amethyst C18-H(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外检测器波长254 nm，柱温40 ℃，流速1 mL·min-1，进样体积10 μL。洗脱液A为乙酸钠-乙腈溶液，B为80%乙腈水溶液，采用梯度洗脱，根据外标和保留时间进行氨基酸定性和定量测定，每样品重复测定3次，取平均值。

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，使用Duncan’s法进行差异显著性分析(P<0.05)，采用Excel 2017软件制作图表。

2 结果与分析

2.1 鱼肥对葡萄果实品质的影响

由表1可见，施用鱼肥后，2种葡萄的单粒重均有显著降低，晨香和维多利亚分别较CK下降4.81%和5.79%；晨香和维多利亚的可溶性固形物含量(TSS)显著高于CK，分别较CK增加12.27%和32.67%；可滴定酸(TA)含量在2个品种上表现不一致，施用鱼肥后，晨香的TA含量显著低于CK，而维多利亚的TA含量与CK差异不显著。

表1 施用鱼肥对葡萄果实品质的影响

生产上常以固酸比作为果实风味的评价指标。施用鱼肥后，晨香和维多利亚的固酸比均显著高于CK，分别提高51.93%和22.22%。综合来看，虽然施鱼肥后果实单粒重有所降低，但TSS含量和固酸比显著提高，果实口味等综合品质得到显著提升。

2.2 鱼肥对葡萄果实游离氨基酸的影响

表2显示了2种葡萄果实的18种游离氨基酸(FAA)组分检测结果，包括8种必需氨基酸(EAA)、2种半必需氨基酸(CEAA)和8种非必需氨基酸(NEAA)。药效氨基酸(MAA)则是通过氨基酸具有药用功效进行分类[22]。由表可见，施用鱼肥前2种葡萄的总游离氨基酸(TFAA)含量整体较低，而施肥后TFAA的含量均显著增加，晨香和维多利亚果实的TFAA含量分别较CK增加116.49%和220.15%。NEAA、CEAA、MAA含量均表现为施用鱼肥后显著增加，其中，晨香葡萄分别较CK增加41.07%、306.99%、190.38%，维多利亚则分别增加79.42%、376.60%、314.61%，且2个品种均以CEAA增幅最大，MAA次之。2种葡萄的必需氨基酸(EAA)含量很低，且试验效果不一致，晨香显著降低，维多利亚显著增加。

表2 鱼肥对葡萄中游离氨基酸组分含量的影响 单位：mg·L-1

比较EAA、NEAA、CEAA及MAA在TFAA中的比例显示，2种葡萄在施肥前后的EAA/TFAA、NEAA/TFAA均显著下降，尽管2个品种的NEAA值较CK显著增加，但由于施用鱼肥的TFAA较CK增幅更大，造成NEAA/TFAA最终较CK下降；CEAA/TFAA和MAA/TFAA均显著增加，其中，晨香较CK分别增加29.73和18.01百分点，维多利亚分别增加23.33和17.19百分点。由上可知，增施鱼肥后，2个葡萄品种的TFAA、NEAA、CEAA、MAA以及CEAA/TFAA、MAA/TFAA均为增加。

2.3 果实游离氨基酸各组分含量的比较

由表2可见，晨香葡萄CK果实的18种FAA各组分含量排序为Arg>Ala>Glu>His>Ser>Pro>Asp>Thr>Ile>Phe>Leu>Val>Tyr>Trp>Met>Lys>Gly>Cys，含量最高Arg为150.05 mg·L-1，相对较高的为Ala和Glu，分别为54.81和46.19 mg·L-1，Thr、Asp、Pro、Ser、His几种含量为39.21～44.46 mg·L-1，其余均处于较低或极低水平；而该品种对应的处理果的游离氨基酸各组分含量排序为Arg>Pro>Ala>Asp>Thr>Ser>Glu>His>Ile>Val>Leu>Phe>Tyr>Gly>Trp>Lys>Cys>Met，最高为Arg，达766.45 mg·L-1，较对照增加410.80%，Arg/TFAA为61.48%，第二和第三的为Pro和Ala，分别较对照增加268.10%和32.37%。维多利亚葡萄中，CK果实游离氨基酸各组分含量排序为Arg>Pro>Ala>Asp>Ile>Thr>His>Ser>Phe>Val>Leu>Glu>Gly>Tyr>Trp>Cys>Lys>Met，而其处理果含量排序为Arg>Ala>Pro>Ser>Thr>Asp>His>Ile>Phe>Val>Leu>Glu>Tyr>Gly>Trp>Lys>Met>Cys，其中Arg、Ala和Pro分别较对照增加401.54%、97.28%、46.24%，且处理果中Arg/TFAA高达68.89%。另外，维多利亚葡萄处理果中含量相对较高的还有Ser，较对照果增加269.10%。总之，2种葡萄的FAA组分以Arg为主，其次为Pro和Ala，均较CK显著增加。

2.4 不同呈味氨基酸的比较分析

葡萄中检测出的18种FAA均为呈味氨基酸，根据其呈味特点分为4类，主要为鲜味氨基酸(delicious amino acid，DAA)、甜味氨基酸(sweet amino acid，SAA)、苦味氨基酸(bitter amino acid，BAA)和芳香族氨基酸(Aromatic amino acid，AAA)[22]。其中，DAA包括Glu、Asp、Lys，SAA包括Thr、His、Ser、Pro、Gly、Ala，BAA包括Val、Met、Leu、Ile、Arg、Trp，AAA包括Cys、Tyr、Phe。

由图1可见，无论是试验还是CK，2种葡萄各呈味氨基酸组分含量由高到低的排序为BAA>SAA>DAA>AAA，且2种葡萄增施鱼肥处理均以BAA增幅为最大，晨香和维多利亚分别较CK增加268.26%和335.11%。同时，SAA也较CK有明显增加，晨香和维多利亚葡萄分别较CK增加43.94%和104.40%。DAA在2种葡萄处理中含量均较低，且变化趋势不一致。其中，晨香处理较CK减少，而维多利亚则略有增加。AAA在2种葡萄呈味氨基酸中含量均为最低，最大值为晨香葡萄的CK，其变化趋势与DAA一致。

图1 葡萄各呈味氨基酸的比较

2.5 不同呈味氨基酸的TAV值比较

由于各类呈味氨基酸的味觉阈值不同，意味着当某种氨基酸含量较高时，对果实的风味不一定产生影响，故采用TAV值进行判定，每种呈味氨基酸的TAV值为其含量测定值与对应味觉阈值的比值。一般情况下，当TAV>1时，表示该物质对样品的呈味有影响，数值越大影响越大；当TAV<1时，则该物质对呈味贡献不大[23]。

对比2种葡萄的试验果和CK果中18种FAA TAV值与其味觉阈值，由表3可见，各呈味氨基酸的TAV值均较小，只有晨香和维多利亚试验果中呈苦味的Arg的TAV值分别为1.53和1.94，表示该类氨基酸对葡萄的呈味有影响，其余各氨基酸组分对呈味的影响不大。

表3 葡萄游离氨基酸的TAV值

3 小结与讨论

葡萄生产中大量化肥的不当使用及大棚设施栽培等会带来果实品质下降和土壤板结、养分失调、酸化、盐渍化等诸多问题[24]，为此，近年出现不少关于施用有机肥对葡萄产量和品质影响的相关研究报道。韩建等[5]认为，有机肥可显著增加葡萄的产量和品质，且随着施用年份的增加，有机肥对葡萄产量和品质的提升趋势会越来越明显；陈青英等[6]开展施用不同有机肥对土壤特性及红地球葡萄生长和品质的影响，试验表明，冬季基肥中增施不同的有机肥，可提高果实品质，其中以施用菜饼肥的果实综合品质最高；范晓晖等[7]研究认为，减施化肥、增施有机肥不仅使得葡萄产量和品质得到提高，还能有效减少土壤大量元素的累积。这些关于葡萄施用有机肥的研究结果基本认为有机肥的合理施用会有效增加土壤有机质含量，缓解土壤板结及酸化，改善土壤微生态环境，提高肥料的利用率，使得果园土壤养分更加丰富，有助于提高葡萄的产量和品质。本研究选择当地有代表性的维多利亚葡萄和新引种的晨香葡萄2个品种，研究冬季基肥施入本地生产的鱼肥对葡萄品质的影响。结果表明，2个品种的单粒果重均有所下降，但品质指标中可溶性固形物含量分别增加12.27%和32.67%，固酸比分别增加51.93%和22.22%，且差异显著，综合理化品质明显提高。

游离氨基酸作为人体维生素E、叶酸等营养素的良好来源[25]，也是果实中重要营养物质和相关风味物质的合成前体[26]，葡萄中氨基酸含量占总氮量的30%～40%[27]，游离氨基酸特别是呈味氨基酸对果实的滋味具有重要贡献[19]。本试验中，晨香和维多利亚葡萄对照果的总游离氨基酸含量分别为575.81和439.24 mg·L-1，低于黄艳[28]研究的3个葡萄品种中含量最低的红玫瑰葡萄；而施用鱼肥后总游离氨基酸分别达到1 246.57和1 406.24 mg·L-1，较对照增加116.49%和220.15%，说明可通过施肥的改变调控葡萄中游离氨基酸含量。Jogaiah等[29]研究认为，Arg和Pro是所有鲜食和酿酒葡萄中的主要氨基酸，Bell等[30]也认为，Arg是葡萄中的含量最高氨基酸，其次是Pro和Leu，且Arg是氮的主要储存形式。本研究的结果为2种葡萄的试验果及CK果的Arg为各组分氨基酸中含量最高，且2种葡萄经施鱼肥后Arg大幅增加，分别为18种游离氨基酸总量的61.48%和68.89%。同时，含量相对较高的还有Pro和Ala，该研究结果与前人结论[29-30]相一致。对于游离氨基酸对食品风味的影响，目前较多采用TAV值进行判断[22,31-32]。本研究结果显示，只有晨香和维多利亚试验果中呈苦味的Arg的TAV值>1，说明其对葡萄的风味有贡献。作为儿童必需氨基酸的Arg呈苦味，有助于增加呈味复杂性和提高鲜度[28,32]。另外，对柑橘中的苦味物质风味的相关研究[33-34]表明，少量苦味能赋予特定的风味，使果汁风味品质更好。基于上述研究理论，结合Arg的呈味特点及其对葡萄的风味影响，可以解释在对这2种葡萄进行口感评价时，增施鱼肥的试验果除了较对照糖度高外，还会略带鲜味，且口感风味更好。

本研究结果表明，施用鱼肥可以显著提高晨香和维多利亚葡萄的可溶性固形物含量、固酸比、游离氨基酸总量，以及精氨酸、脯氨酸等组分，其中试验果的精氨酸对果实风味有贡献，使果实综合品质得以提高，风味更好，值得在沿海地区推广应用。