基于正交设计优化白花蛇舌草提取工艺及含量测定*

李雅婷 盛云杰

(浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053)

白花蛇舌草为茜草科耳草属一年生草本植物，全草入药，其味微苦、微甘，性凉，入心、肝、肺经，具有利湿通淋、清热解毒、收敛止血等作用[1]。白花蛇舌草主要含有萜类、甾醇类、蒽醌类、黄酮类等活性成分[2，3]，还含有Se、Mn、Ti、Zn、Mo等微量元素[4]。齐墩果酸和熊果酸为已知的主要三萜类活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、护肝解毒、降血压、调血脂、抗氧化、保护神经系统等作用[4-7]。由于齐墩果酸和熊果酸为仅29、30位甲基位置不同的同分异构体，故二者性质相近，较难分离。本实验建立白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸的HPLC测定方法，实现基线分离且出锋时间较快，同时对白花蛇舌草的最佳提取工艺进行了研究，以期为白花蛇舌草的充分开发利用、药理作用的研究提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695 高效液相色谱仪(Waters公司，美国)；WJX-100型高速多功能粉碎机(上海缘沃工贸有限公司)；BT25S十万分之一电子分析天平(德国塞多利斯公司)；PHS-2C 酸度计(上海理达仪器厂)；KQ5200B型超声波清洗器(最大超声功率150W，昆山市超声仪器有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(广州市康恒仪器有限公司)；UPT-II-20T超纯水仪(四川优普超纯科技有限公司)。

1.2 药品及试剂 齐墩果酸对照品(批号：KB150122，上海圻明生物科技有限公司，HPLC≥98%)；熊果酸对照品(批号：KB150316，上海圻明生物科技有限公司，HPLC≥98%)；乙腈(色谱纯)；乙醇等其他试剂均为分析纯；水为自制超纯水；磷酸二氢钾；磷酸氢二钠。

2 方法与结果

2.1 指标成分的含量测定

2.1.1 药材粉碎与干燥 将白花蛇舌草药材分别粉碎，过100目筛，称重，置已干燥至恒重的蒸发皿中，于减压干燥箱中干燥12 h，至恒重。

2.1.2 供试品溶液配制 称取的白花蛇舌草粉末2.50 g，置50 mL三角瓶中，加入40 mL无水乙醇，称重，超声提取40 min，补足重量，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得。

2.1.3 对照品溶液配制 精密称取齐墩果酸对照品2.03 mg、熊果酸对照品4.12 mg，加无水乙醇溶解，转移置50 mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，制得齐墩果酸、熊果酸浓度分别为0.040 6 mg·mL-1、0.082 4 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.4 色谱条件 色谱柱：Aglient C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液pH=6.8(70∶30)；检测波长：210 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：5 μL。在此色谱条件下，齐墩果酸和熊果酸可达到基线分离。齐墩果酸(tR=12.7 min)和熊果酸(tR=13.9 min)的分离度>1.5。见图1。

注：A-混合对照品溶液; B-供试品溶液; 1-齐墩果酸; 2-熊果酸。图1 混合对照品溶液和供试品溶液HPLC图谱

2.1.5 标准曲线绘制 精密吸取 “2.1.3” 项下对照品储备液分别进样1、4、8、12、18、24、32μL。依 “2.1.4” 项下色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标(Y)，相应质量浓度为横坐标(X)计算回归方程，得回归方程分别为：齐墩果酸Y=1282.5X-19 006，r=0.999 2；熊果酸Y=1945.4X-29 402，r=0.999 1。表明齐墩果酸在0.040 6～1.299 2 μg，熊果酸在 0.082 4～2.636 8 μg范围内，线性关系良好。

2.1.6 精密度试验 按“2.1.4”项下色谱条件测定混合对照品溶液，连续进样共6次，计算得齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD值分别为0.75%、0.98%，结果表明仪器性能良好。

2.1.7 稳定性试验 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，取同一份供试品溶液，分别于制备后0、2、6、10、16、24 h，按“2.1.4”项下色谱条件进样测定，齐墩果酸和熊果酸峰面积RSD分别为1.45%、1.04%。表明该方法制备的供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8 重复性试验 取同批次白花蛇舌草药材(产地：江西，生产批号：20140304，购自杭州胡庆余堂)粉末5份，按“2.1.2”项下方法制备该批样品的供试品溶液，并按照“2.1.4”项下色谱条件进行含量测定，计算得齐墩果酸和熊果酸含量的RSD值分别为0.33%、1.32%，表明本实验方法重复性良好。

2.1.9 加样回收试验 精密称定9份已知齐墩果酸和熊果酸含量的白花蛇舌草粉末，每份约0.12 g，分别加入熊果酸、齐墩果酸的标准溶液，平行3份，按“2.1.2”项下方法提取，计算得熊果酸、齐墩果酸的平均回收率分别为102.22%、100.78%，RSD分别为0.83%、0.46%。见表1。

表1 白花蛇舌草中2个定量成分的加样回收率 (n=9)

2.2 白花蛇舌草提取工艺优化

2.2.1 单因素试验 乙醇浓度的选择：共设5个梯度，即60%、70%、80%、90%、100%。称取白花蛇舌草粉置三角瓶中，加相应浓度乙醇40 mL，称重，超声提取40 min，补足重量，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液。根据“2.1.5”中的回归方程计算齐墩果酸和熊果酸的总提取率。

提取时间的选择：共设5个时间梯度，即10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。称取白花蛇舌草粉末置三角瓶中，加无水乙醇40 mL，称重，超声提取 40 min，补足重量，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液。根据“2.1.5”中的回归方程计算齐墩果酸和熊果酸二者的总提取率。

料液比的选择：共设5个料液比(g∶mL)梯度，即1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100。精密称取白花蛇舌草置三角瓶中，加入相应体积的无水乙醇，称重，超声提取40 min，补足重量，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液。根据“2.1.5”中的回归方程计算齐墩果酸和熊果酸二者的总提取率。

提取功率的选择：共设5个功率梯度，即90 W、105 W、120 W、135 W、150 W。精密称取白花蛇舌草粉末置三角瓶中，加入40 mL无水乙醇，称重，按相应的提取功率超声提取40 min，补足重量，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液。根据“2.1.5”中的回归方程计算齐墩果酸和熊果酸二者的总提取率。见图2。

图2 单因素实验对提取率的影响

2.2.2 正交试验 根据图2单因素试验结果，选取提取溶剂(乙醇)浓度、料液比、提取时间、提取功率为考察因素，以齐墩果酸和熊果酸二者的总提取率为考察指标，每因素选取3个水平，选用L9(34) 因素水平表，采用超声提取法对白花蛇舌草进行提取工艺的研究。见表2。

表2 白花蛇舌草提取工艺正交试验因素水平表

根据齐墩果酸和熊果酸的总提取率，通过直观分析可知，各因素对有效成分提取量影响主次为B>A>D>C，即乙醇体积>乙醇浓度>提取功率>提取时间。见表3。通过方差分析可知，乙醇浓度(A)、溶剂体积(B)对提取率有显著影响(P<0.05)，提取时间(C)、超声提取功率(D)对提取率无显著影响，故从节约时间的角度考虑，提取时间为30 min较为合适，所以最佳提取工艺组合为A2 B3 C1 D3，即加浓度为90%乙醇40 mL，80%的功率，超声提取 30 min。见表4。

2.2.3 工艺验证试验 按最佳提取工艺进行3批验证试验，根据“2.1.5”中的回归方程计算齐墩果酸和熊果酸二者的总提取率，见表5。用该工艺提取白花蛇舌草中齐墩果酸、熊果酸及二者总含量均较高，实验数据平行性较好，表明该优化工艺稳定可行，可作为白花蛇舌草的最佳提取工艺。

3 讨论

由于超声提取操作简便，提取效率高，故在本实验中，供试品的制备采用超声提取法。笔者用超声提取法分别考察了以甲醇、乙醇作为提取溶剂对齐墩果酸和熊果酸提取率的影响，结果显示乙醇的提取率更高，且乙醇安全无毒、经济易得，故选择乙醇作为提取溶剂。

中药中熊果酸和齐墩果酸常共存，二者由于性质相似，故较难分离。按文献报道[8-11]的流动相分离熊果酸和齐墩果酸，存在峰形差、出峰时间长、分离度不够理想等问题。本实验首次尝试了以乙腈-磷酸缓冲盐作为流动相，通过调节磷酸缓冲盐pH值，分别考察了其为pH=6.8和pH=7.2时对齐墩果酸和熊果酸的分离效果，结果显示，pH=6.8时，二者分离效果佳、峰形好、出峰时间短、基线平稳，故最终确定流动相为乙腈-磷酸缓冲盐pH=6.8(70∶30)。但不足之处在于随着pH值的缩小，峰形得到改善，但出峰时间延长，故考虑在今后的实验中可对其pH值的调整进行细化研究，以期得到更佳的流动相。

表3 白花蛇舌草提取工艺L9(34)正交试验设计与结果

表4 白花蛇舌草提取工艺正交设计方差分析表

表5 白花蛇舌草提取工艺验证试验表 (mg·g-1)

由于齐墩果酸和熊果酸均与白花蛇舌草抗肿瘤、抗炎作用密切相关，且为已知的主要三萜类活性成分，故选取主要活性成分齐墩果酸和熊果酸作为考察指标，采用正交试验法优化了该药材提取工艺。实验结果表明，提取过程中要注意乙醇浓度的选择。另外，本实验中超声提取功率及提取时间虽对齐墩果酸和熊果酸的提取率无显著性影响，但单因素试验结果表明提取功率过大，实验药材有效成分的提取率反而下降，这可能是由于过大的功率使得杂质溶出量增大，故仍需合理控制参数，由此也可见推进多频变功率式超声波中药提取设备研究的必要性。该优化工艺可为白花蛇舌草抗肿瘤制剂研究应用及其综合开发利用提供科学依据。