Y编码样睾丸特异性蛋白5在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用

范怡伦 吴佳伟 丁丹 黄一航 薛松 黄日太

心肌缺血再灌注损伤的发生涉及多种机制，如氧自由基的产生、钙离子超载、炎性反应等[1-4]。如何减轻缺血再灌注引起的心肌损伤，仍是心血管临床医生面临的难题。

Y 编码样睾丸特异性蛋白5 基因（TSPYL5）位于染色体8q22 位点，是1 种与乳腺癌预后不良有关的独立标记物[5-6]。有研究显示TSPYL5 可以刺激多种细胞增殖[7]，参与细胞生长调节关键物p53 的负向调控[6]，如通过抑制p53 促进内皮细胞的增殖和功能[8]。本研究探究在心肌缺血再灌注损伤中，TSPYL5 能否通过抑制p53 信号通路，减少心肌细胞凋亡，从而起到保护心肌的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用主要试剂与仪器有H9c2 心肌细胞株（上海中国科学院细胞库）；抗TSPYL5、GAPDH、p53、Bcl-2、caspase-3 抗体（ABclonal）；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（碧云天）；聚合酶链反应（PCR）扩增试剂盒（TaKaRa）；Lipofectamine 3000 转染试剂（Invitrogen）；BCA试剂盒（碧云天）等。

1.2 H9c2心肌细胞培养与分组

将H9c2 心肌细胞培养于DMEM 培养基中。将细胞随机分组：对照组按照常规方式培养细胞；缺氧复氧组将常规培养基换为无血清培养基，置于含1%O2、95%N2的缺氧培养箱中培养12 h，再将细胞放回37 ℃、5%CO2培养箱中培养6 h。

1.3 TSPYL5过表达体系的构建

将H9c2 细胞接种在6 孔板中培养24 h。将2.1 μg TSPYL5 过表达质粒与5 μL 的P3000 溶于100 μL 无血清无抗生素的培养基中混匀；再将5 μL Lipofectamine 3000 溶于100 μL 无血清无抗生素的培养基中混匀，静置15 min；将上述两者轻柔混匀后，加入换有新鲜正常培养基的培养孔。继续培养48 h 后，过表达体系构建完成。

1.4 小鼠心脏缺血再灌注模型的构建

给予6～8 周雄性C57BL/6 小鼠腹腔注射1.2%异氟烷进行麻醉，气管插管后于小鼠胸骨左侧3、4肋间剪开皮肤，打开胸腔，用手术缝线对侧牵拉肋骨使心脏暴露。剪开心包，找出左心耳下缘的红色血管即左前降支，打1 活结进行结扎，暂时关闭胸腔。30 min 及2 h 后再次开胸，打开活结，看到心壁苍白区域再次变红，即为再灌注成功。

1.5 TUNEL染色检测细胞凋亡

将细胞种入底部放有玻片的12 孔板，经缺氧复氧处理后使用多聚甲醛固定30 min，使用PBS 洗涤后根据凋亡试剂盒说明书进行操作。直接置于光学显微镜下观察。

1.6 Western blot检测蛋白水平

细胞蛋白经RIPA 裂解提取后，使用BCA 定量法测定蛋白浓度。使用10%的SDS-PAGE 凝胶电泳分离出分子量大小不同的蛋白，将其转移至PVDF 膜上，使用快速封闭液将膜封闭后，一抗孵育过夜。TBST 洗膜后常温避光孵育二抗2 h，洗膜后使用Odyssey Clx 扫膜。

1.7 统计学分析

使用Graphpad Prism 9 软件进行统计学分析与作图，实验数据采用均数±标准差表示，其中非配对t检验用于进行2 组样本间的比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血再灌注后小鼠心肌TSPYL 5表达下调

为探究动物模型中TSPYL 5 的表达水平是否与缺血再灌注损伤有关，实验设立了对照组、缺血0.5 h 组、再灌注0.5 h 组与再灌注2 h 组，进行蛋白表达水平检测。与对照组相比，缺血再灌注0.5 h和2 h 后小鼠心肌组织TSPYL5 的蛋白表达水平明显下降。再灌注2h 的小鼠TSPYL5 的蛋白表达水平下降最显著（P均＜0.05）。见表1。

表1 小鼠心肌细胞缺血再灌注后的蛋白表达水平

2.2 缺氧/复氧后H9c2细胞凋亡显著增加

与对照组相比，缺氧/复氧后细胞TSPYL 5 的表达水平显著下降，与此同时，p53、caspase-3 的蛋白表达水平显著上调，促凋亡蛋白Bcl-2 的表达显著下调（P均＜0.05），提示细胞在缺氧/复氧后发生凋亡，见表2。

表2 H9C2细胞中TSPYL 5与凋亡通路蛋白表达水平

2.3 TSPYL5过表达逆转了缺氧/复氧后的细胞凋亡

在H9c2 细胞中建立TSPYL5过表达体系，p53 与caspase-3 的蛋白表达水平显著下调，Bcl-2的蛋白表达水平显著上调（P均＜0.05），提示在过表达TSPYL5后细胞凋亡被明显抑制。见图1、表3。

表3 过表达TSPYL5后凋亡通路蛋白表达水平

图1 TSPYL5过表达的构建

在转入质粒后，与对照组相比，TSPYL5的高表达显著抑制了缺氧/复氧后细胞的凋亡水平，见图2。

图2 缺氧/复氧后Tunel染色结果（×25）

3 讨论

TSPYL5 在细胞中广泛表达，既往研究表明其可以促进多种肿瘤细胞的增殖[7]，也可以通过与泛素特异性蛋白酶7（USP7）结合的方式对p53 通路产生抑制作用[6]，通过这种作用可以促进内皮细胞的增殖和功能[8]。然而，TSPYL5 蛋白能否通过抑制p53 通路在心肌缺血再灌注损伤中产生保护作用，还尚未有报道。

首先，本研究发现在小鼠缺血再灌注模型中TSPYL 5 的表达水平均有下调，其中再灌注2 h 组下调最显著。在后续的体外实验中，这样的差异也同样被验证。这说明TSPYL 5 的表达水平与心肌缺血再灌注存在一定的联系。

p53 是肿瘤抑制蛋白，在细胞面临缺氧/缺血压力时，它是细胞周期与凋亡的关键调节物[9-10]。本研究检测到p53 凋亡信号通路蛋白即Bcl-2、caspase-3、p53 表达水平的变化，证实了H9c2 细胞在缺氧/复氧模型中发生了显著凋亡。

已有研究表明，抑制p53 介导的凋亡信号通路可以显著地减少缺血再灌注导致的心肌损伤[11-12]。而且TSPYL5 已被证明可以通过与USP7 相互作用抑制p53，从而消除p53 介导的凋亡效应[6]，比如促进内皮细胞的增殖[8]等。本研究已经验证TSPYL5 在缺氧/复氧后表达水平会发生下调，由此进一步探究在水平心肌细胞缺氧/复氧模型中，高表达TSPYL5是否能通过抑制p53 信号通路对细胞产生保护作用。TSPYL5过表达细胞体系被成功构建之后，结合蛋白表达水平与Tunel 染色结果提示，过表达TSPYL5通过抑制p53 信号通路逆转了心肌细胞缺氧/复氧后的凋亡水平。

以上研究结果表明，TSPYL 5 在心肌缺血再灌注后表达下调，通过抑制p53 信号通路的方式，发挥心肌细胞保护作用。本研究仅在体外验证了TSPYL5 对心肌细胞的保护作用，尚未进行体内实验。TSPYL5 能否在小鼠缺血再灌注模型中实现对心肌的保护作用，以及在未来如何将TSPYL5 作为潜在靶点，从而减轻心肌缺血再灌注损伤，需要后续深入研究。