羔羊被动免疫建立过程及检测方法研究进展

田星哲，田沛知，李金辉，杨彩虹，严 慧，张英杰，纪守坤，刘月琴

（河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000）

羔羊出生时自身免疫系统发育不健全，难以产生自身抗体，需要从母畜获得抗体建立被动免疫，因此初乳成为羔羊获得抗体，建立生命早期免疫力的唯一途径。哺乳期羔羊血清IgG 含量低，免疫力弱是羔羊患病和死亡的主要原因，羔羊受母羊生理状况，初乳质量、初乳摄入时间等因素影响存在被动免疫转移失败的风险。羔羊被动免疫水平会显著影响哺乳期的患病率、死亡率和生长性能。围绕被动免疫建立过程和检测方法，前人在犊牛上已进行了大量研究，但在羔羊上的研究较少。目前羔羊被动免疫的建立没有成熟的理论体系支撑，无法有效帮助羔羊建立被动免疫，同时羊具有多羔特点，羊初乳产量和成分也与牛初乳存在显著差异，因此本文对羔羊被动免疫建立过程和检测方法进行综述，为通过提高羔羊被动免疫成功率保障羔羊哺乳期健康提供指导。

1 羔羊被动免疫建立过程

1.1 羊初乳中的营养素与免疫成分 初乳含有大量的营养素，包括蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素、矿物质等，是羔羊早期生长发育的能量和物质来源，羔羊吸收初乳中的营养素为自身被动免疫的建立奠定体质基础。初乳中的营养素含量高于常乳，杨晓宇在测定萨能奶山羊初乳中营养素后指出，初乳中总干物质占比为10.24%，蛋白质为21.32%，脂肪为7.73%，灰分为1.57%，其中维生素种类丰富，可满足羔羊生长所需，Ca、Zn、Na、Al、Mg、Cu、Fe 等常量及微量元素也远高于常乳。

初乳中不仅含有丰富的营养素，还存在大量免疫成分，特别是在反刍幼畜出生早期发挥免疫调节功能。前人研究表明，初乳中富含硫氰酸盐、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、氢过氧化物酶、细胞因子、生长因子、免疫调节因子和免疫球蛋白（Ig）等免疫活性物质，其中免疫球蛋白是新生幼畜建立被动免疫力的主要保障，在新生幼畜的培育中受到广泛关注。初乳中的免疫球蛋白主要为免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白A（IgA）3 种，IgG 可促进巨噬细胞的吞噬作用，并具有激活补体、中和毒素、抗菌抗病毒等多种生物学活性，IgM 可促进吞噬细胞的吞噬作用并且对细菌等颗粒抗原发挥免疫作用，IgA 可分布在肠道黏膜上直接发挥抗体作用，减少病原微生物的侵入。灵长类动物初乳中免疫球蛋白主要为IgA，例如人初乳中 IgA 占Ig 总量的89.8%，而IgG 仅占到Ig 总量的0.02%；而家畜动物初乳中免疫球蛋白以IgG 为主，猪初乳中IgG 浓度为58.7 mg/mL，占Ig 总量的80%以上；牛初乳中IgG 含量为50.5mg/mL，占Ig 总含量的86%以上；由于品种间差异，羊初乳中IgG 含量变异较大，山羊初乳中IgG 含量在28.2～72 mg/mL，绵羊初乳中IgG 含量在37～79 mg/mL，占初乳中Ig总量的85%以上。根据IgG 分子亚基和抗原特异性的不同，IgG 可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 4 个亚类，IgG1 占IgG 总量的80%～90%，IgG2 占IgG 总量的10%～20%，其中IgG1 是机体再次免疫应答时发挥免疫作用的主要成分。

1.2 初乳IgG 的吸收过程 IgG 分子由2 部分组成，分别为Fab 段和Fc 段，Fab 段可以和抗原进行特异性结合，起到识别抗原的功能，Fc 段无识别抗体能力但可与细胞上Fc 受体结合，起到引导、定位和跨细胞转运的作用。反刍幼畜对IgG 的吸收在小肠进行，小肠上皮细胞刷状缘存在新生儿Fc 受体（FcRn），作为IgG 在乳腺和肠道转运的唯一受体，FcRn 在新生儿小肠近端大量表达，并且FcRn 特异性结合IgG 的Fc 段，将IgG 吸附于小肠上皮细胞表面，经过胞吞转运到小肠上皮细胞基底面，之后以胞吐的方式进入血液循环。FcRn 介导的胞吞作用在羔羊出生后24 h 内较活跃，随后小肠上皮细胞快速发育成熟，丧失跨细胞转运IgG 的功能，形成肠闭合。

1.3 羔羊被动免疫成功建立的标准 新生羔羊免疫力低下，对环境的适应能力较差，因此容易受到环境应激影响和大肠杆菌等病原微生物的侵袭，从而发生感冒、腹泻、痢疾、口腔炎、肺炎等一系列疾病，影响羔羊生存，被动免疫的建立有利于羔羊抵御微生物的侵袭，保障羔羊的正常生长。在生产上，常测定幼畜出生后12～72 h血清IgG 含量来评价被动免疫建立水平，这是因为反刍幼畜在采食初乳后6 h 达到IgG 吸收高峰期，12 h内可完成对IgG 的吸收，随后3 d 内血清IgG 含量处于较稳定的状态。在犊牛上，Besser指出10 mg/mL的血清IgG 浓度是评判被动免疫建立的临界值，但是Tyler 等和Selim 等分别提出血清中12、15 mg/mL的IgG 浓度可作为犊牛建立被动免疫的最佳临界值，Chigerwe 等研究认为20～25 mg/mL 是犊牛被动免疫建立的更好的判断标准。不同研究者判断犊牛成功建立被动免疫的血清IgG 值在逐年提高，原因可能是更高的血清IgG 水平可以更有效地保障新生犊牛的健康，随着饲养管理技术的提高使用更高被动免疫评价标准成为可能。目前对于羔羊被动免疫的研究仍较为匮乏，尚未形成统一的行业标准。O'Brien 等在研究山羊羔羊血清IgG 含量与其断奶存活率的关系后，推荐血清IgG 浓度12 mg/mL 作为羔羊建立被动免疫的临界值。而Turquino 等研究高热天气对羔羊被动免疫转移的影响，推荐绵羊被动免疫评价标准为血清IgG 含量在15 mg/mL，与Alves 等的研究结果一致。羔羊被动免疫建立成功的标准尚待进一步研究。

2 影响羔羊被动免疫的因素

初乳质量、初乳饲喂量、初乳饲喂时间、幼畜的生理状况等均可影响新生羔羊被动免疫建立，其中初乳质量、初乳饲喂量和初乳饲喂时间是主要影响因素，生产上关注度较高。

2.1 初乳质量 初乳质量是影响羔羊被动免疫成功与否的重要因素，羔羊只有摄入优质初乳，才能最大程度保证羔羊自身被动免疫的建立。一般初乳质量评估包括两方面内容，其一为初乳中IgG 含量，其二为初乳中微生物含量。

初乳中IgG 含量受母畜品种和生理状况、胎次和产仔数等多种因素影响，不同研究中初乳IgG 含量变化较大。在牛初乳上，一般认为优质初乳IgG 含量的临界值为50 mg/mL。目前优质羊初乳研究较少，Zobel 等在研究折射仪与比重计测量羊初乳质量后，推荐用20 mg/mL IgG 的初乳来饲喂羔羊；Alves 等在研究不同时期乳成分和抗体浓度时，以20mg/mL IgG作为优质初乳的临界值；Castro 等在探究折射仪评估羊初乳中IgG 含量的可行性时，同样认为20 mg/mL IgG 含量为优质初乳的临界值。因此，目前可将IgG 含量在20 mg/mL 以上的初乳作为优质初乳，用以饲喂羔羊，从而保障羔羊对IgG 的吸收。

初乳中存在大量微生物，Malmuthuge 等研究表明，乳酸菌、双歧杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、大肠菌群和链球菌等多种微生物普遍存在于初乳中，优质初乳中微生物总含量应低于10cfu/mL 或大肠杆菌数低于10cfu/mL。初乳中乳酸菌、双歧杆菌被广泛用做益生菌，但链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌等病原微生物会对幼畜健康产生威胁，这种威胁主要体现在两个方面：其一是病原菌直接导致动物患病，因此饲喂巴氏杀菌后的初乳有利于降低幼畜腹泻等感染性疾病；其二初乳中病原微生物可与IgG 结合，降低初乳中可吸收IgG的有效含量，抑制羔羊对IgG 的吸收，因此经过巴氏杀菌法灭杀初乳中的病原微生物，可以提高小肠对IgG 的吸收效率，有利于羔羊被动免疫的建立。

2.2 初乳饲喂量 初乳饲喂量是幼畜养殖过程中的关注重点，只有保证足够的饲喂量才能更有效的帮助幼畜建立被动免疫。在犊牛上，一般推荐饲喂其初生重10%～12%的初乳，生产上常采用犊牛出生后2 h 内饲喂3～4 L 初乳，12 h 后再次饲喂2 L 优质初乳，保障被动免疫建立的成功率。羊初乳产量低于牛初乳，并且存在一胎多羔现象，因此羔羊初乳饲喂量常得不到保证。Mellor 等研究表明，为保证羔羊建立被动免疫,应在出生后18 h 内按照羔羊初生重，每千克体重摄入180～210 mL 初乳。而Alves 等认为，羔羊需要在出生后24 h 内摄入至少30 g IgG，保障被动免疫建立成功率。

2.3 初乳饲喂时间 幼畜出生后小肠上皮细胞快速发育，对初乳中IgG 的吸收效率逐渐降低，在出生后24 h 后发生肠关闭，无法将初乳中完整形式的IgG 转移到血液中。Stott 等研究表明，幼畜出生后6 h 内小肠对IgG 的吸收效率约为50%，在20 h 后迅速下降到12%。Godden研究也证实了幼畜出生后6 h 内肠道对初乳的吸收量最高，6～12 h 缓慢下降，24 h 时基本结束。而母羊在产后10～12 h 内IgG 水平也会发生明显下降。因此，生产上应在羔羊出生后尽早喂服足量的优质初乳，保障羔羊对IgG 的吸收效率和被动免疫成功率。

3 羔羊被动免疫检测方法

3.1 单向免疫扩散法（RID） RID 是将一定量的抗IgG 抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，使IgG 在琼脂板中自由扩散，IgG 与抗IgG 抗体发生沉淀反应，最后在孔周围形成放射性沉淀环，根据沉淀环直径与IgG 浓度的关系确定初乳与血清中IgG 浓度。这种方法使用方便、成本低，检测准确度高，因此大量研究将其作为评估初乳和血清IgG 浓度的金标准。然而RID 法需要由有经验的人员在实验室进行，耗时较长，制约了该方法在实际生产中的使用。

3.2 酶联免疫吸附测定法（ELISA） ELISA 方法一般分为间接法、双抗体夹心法和竞争法，其中双抗体夹心法由于其敏感性高而使用较广泛，此种方法将酶分子与抗体分子共价结合，形成酶标抗体，再与吸附在固相载体上的抗原发生特异性结合，滴加含酶的底物溶液后，底物可在酶作用下由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应，以此确定初乳或血清中IgG 或蛋白含量。ELISA 法已被广泛应用于初乳质量的检测以及羔羊被动免疫建立的评定，有研究认为，基于ELISA 法时羔羊血清IgG 含量在15 mg/mL 以上或总蛋白含量高于45 mg/mL可以判定被动免疫建立成功。ELISA 法特异性强，敏感度高，但同时对设备、试验操作和环境要求高，检测成本较高，常用于被动免疫的实验室测定。

3.3 Brix 折射仪法 折射仪（Brix）法是应用光线在不同的透明介质中的折光现象，利用初乳或新生反刍动物血清中蛋白含量与IgG 含量的正相关关系，通过间接测定初乳或血清中蛋白含量估测其中IgG 含量的方法。Morrill 等证明，Brix 折射仪读数与初乳和血清中IgG 含量正相关，可用于初乳品质的判定和犊牛被动免疫转移的识别。Brix 读数高于20.9%时表明初乳中IgG含量高于50 mg/mL，为优质初乳。Mcguirk 等研究认为，健康犊牛血清总蛋白含量高于52 mg/mL，即Brix 值高于7.9%时，判定犊牛已成功建立被动免疫转移。绵羊在产后12 h 内，初乳乳蛋白浓度与初乳中免疫球蛋白有较强的正相关关系，因此，折射仪估算母羊初乳IgG 浓度是评估初乳质量的一种有效方法，初乳中IgG 含量高于20 mg/mL，Brix 读数高19%时，被认为是优质初乳。目前折射仪在检测羔羊被动免疫建立方面应用较少，有待于进一步研究。尽管Brix 折射仪方法准确性低于RID 方法，但其操作简单，对环境条件要求低，测定速度快，更适于在生产上应用。

3.4 毛细管电泳法（CE） CE 是一种基于带电粒子在电场作用下，在液体介质中运动的分析方法，利用不同粒子的迁移速度取决于它们的电荷、形状和大小，以及溶液环境和电场强度，完成不同的粒子在迁移过程中的分离和鉴定。目前CE 成功应用于母羊初乳品质的检测，Ceniti 等使用CE 仪器成功分离出母羊初乳清蛋白质，并在电泳图中鉴定出与总Ig 对应的部分。CE 法也可应用与羊奶制品中牛奶掺假的检测，Morittu比较RID 和CE 2 种方法，结果显示，CE 与RID 具有较强的相关性。CE 法较之RID 法具有分离效率高、运行时间短、成本低等优点，但对设备和试验操作技能要求较高，可以作为实验室检测方法。

3.5 免疫传感器法 免疫传感器将羊特异性IgG 与选择性抗体辣根过氧化物酶（HRP）特异结合并固定在磁性微珠（MBs）上，通过HO/ 对苯二酚（HQ）系统测量两极电流，电流大小与IgG 浓度成正比关系，因此，可使用免疫传感器法检测初乳和血清中IgG 含量。研究表明，免疫传感器法在牛IgG、绵羊IgG、山羊IgG 上的检测下限为0.74、0.82、0.66 ng/mL。此方法检测精度极高，不仅可以检测羔羊血清IgG 含量，还可应用于乳制品掺假的检测。免疫传感器法具有分析快速、灵敏度高、样品需要量少的优势，但对设备和技术依赖度高，适合在规模化检测公司和大牧场中使用。

4 小结

新生羔羊成功建立被动免疫是提高机体抵抗力、降低疾病发生率的有效措施。羔羊被动免疫的建立与初乳品质、饲喂量和饲喂时间密切相关，保证羔羊尽早摄入充足的优质初乳是成功建立被动免疫的关键。被动免疫在犊牛上的研究较多，已形成行业共识，有效促进了犊牛培育水平的提高，但绵羊和山羊泌乳量、初乳成分和产羔数均与奶牛存在明显差异，羔羊被动免疫建立过程、被动免疫水平的评价标准和检测方法研究较少，产业上尚未形成统一认识，是制约羔羊培育进步的重要方面之一，对该问题的深入研究必能有效提高羔羊的培育水平，增加羔羊繁育的经济效益。