重组促卵泡激素在哺乳动物辅助生殖中的应用研究进展

朱雪丹，曾繁文，潘学情，马君艳，张守全

（华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广东广州，510642）

促卵泡激素（Follicle-Stimulating Hormone，FSH）是哺乳动物垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白激素（Glycoprotein Hormone，GPH），对卵巢卵泡发育和睾丸精子发生至关重要，是辅助生殖中不可或缺的促性腺激素。FSH 与促黄体激素（Luteinizing Hormone，LH）、绒毛膜促性腺激素（Chorionic Gonadotropin，CG）同为异二聚体，属于GPH 家族，拥有一个共同的由92 个氨基酸残基组成的亚基和1 个决定受体特异性的亚基。两亚基只有组装在一起才具有活性，FSH完全缺陷的模型小鼠中，雌性卵巢功能严重受损，表现出不孕，雄性虽可育但支持细胞数量减少一半，精子密度也严重降低。

天然FSH 主要通过肾脏、肝脏被灭活，在外周血中的半衰期为2～4 h。为了提高哺乳动物的繁殖效率，临床上需要长效的FSH 以满足周期卵泡的发育与成熟。20 世纪以来，随着基因重组技术和高精度细胞培养技术的问世与推广，研究者在体外成功构建了不同类型的重组FSH（Recombinant FSH，rFSH），它们具有成分单一、活性高、半衰期长、生产成本低、产品批次稳定等优点。研究表明，通过糖基化修饰或添加具有rFSH 保护作用的片段均可增加其在体内的稳定性与高效性。本综述主要围绕FSH 的信号通路及FSH 的N-糖基化修饰、O-糖基化修饰、新生儿可结晶片段受体（Neonatal Fragment Crystallizable Receptor，FcRn）和聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）化5 方面来叙述rFSH 在雌性哺乳动物辅助生殖中的作用。

1 促卵泡激素的分泌调控

FSH 的合成包括亚基的转录、翻译、组装、糖基化修饰等复杂步骤，糖链的合成始于内质网，然后在高尔基体中修饰成为有活性的FSH，最终由腺垂体分泌。垂体FSH 的分泌严格受下丘脑促性腺激素释放激素（Gonadotropin-Releasing Hormone，GnRH）的脉冲频率调节，较低频率的GnRH 脉冲主要通过环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-Response Element Binding Protein，CREB）信号途径刺激启动子优先产生FSH，较高频率的脉冲主要调控垂体分泌LH。垂体分泌的FSH 通过血液循环与性腺上FSH 受体（FSH Receptor，FSHR）结合，随后Gs 蛋白解耦连引发FSHR 脱敏，-抑制蛋白内化，触发下游细胞外信号调节激酶（Extracellular Signal-Regulated Kinase，ERK）/ 丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosp hatidylinositol 3-Kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein Kinase B，AKT）2 条中央调控通路，刺激靶腺激素（雄激素、雌激素、孕激素）分泌，从而调控哺乳动物的繁殖活动，例如雌性卵泡发育和雄性精子发生。通路中的重要信息分子PI3K、MAPK 被抑制后，FSH 诱导的卵泡生长也会被中断。在卵巢周期中，性腺类固醇激素、抑制素等也与GnRH 共同参与FSH 的分泌调控，黄体退化导致血清雌二醇（Estradiol，E）、孕酮、抑制素A 降低，GnRH 的抑制作用解除，随后GnRH 脉动调控FSH 分泌，当FSH 水平稳定后，卵泡颗粒细胞产生的E、抑制素B 再负反馈调节FSH 的分泌，当FSH 降低到阈值时，除优势卵泡外，其他大部分卵泡都会发生闭锁。添加外源性FSH 可维持血清FSH 高于阈值，让更多的卵泡有机会生长发育，也让更多的颗粒细胞可以充分发挥分泌类固醇的功能，以增强对卵巢的辅助调控作用。

2 糖基化

蛋白质的糖基化主要包括N-糖基化和O-糖基化2种类型。糖基化修饰可以让一些敏感的氨基酸位点被保护起来，增加蛋白的稳定性和生物活性。FSH 分子表面有多种不同类型的N-糖基化，如岩藻糖、硅铝酸、唾液酸等，其中唾液酸的含量与类型主要通过影响肾脏的代谢进而影响FSH 的半衰期。因此，为获得长效稳定功能的rFSH，可以通过调整糖基化的数量及其类型来实现。

2.1 N-糖基化 天然的全糖FSH 亚基上存在4 个N-糖基化位点，亚基上有2 个，分别在Asn和Asn位，主要调控FSH 的分泌、亚基稳定性及信号转导；另外2 个在亚基的Asp和Asp位，主要调控FSH 的组装、半衰期与生物活性。通常纯化的人类垂体或尿源性FSH（Urine FSH，uFSH）会存在亚基不同程度的糖基化，以亚基分子量大小来命名，其中同时含有Asn和Asp位糖基化的是全糖FSH，含量最多；只有Asn或Asp位糖基化的是低糖FSH或FSH，统称FSH；完全没有糖基化的是FSH，不能被组装和分泌，含量最少。随着年龄增长，FSH 的糖基化程度越高，即青年阶段主要以FSH为主，绝经后主要以全糖FSH（uFSH）为主。

然而，并非糖基化程度越高，其生物活性越高，FSH在体内至少能产生类似于FSH的生物活性。虽然2 种rFSH 糖型都能诱导体内卵泡发育，但FSH可通过更强的作用激活RTK、PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信号来加强对优势卵泡的选择和对颗粒细胞的增殖作用。鉴于人与猪生理上的相似性，有团队首次在猪原代颗粒细胞中比较了2 种糖型的生物活性，结果表明低糖基化rFSH 在刺激cAMP 积累、诱导转录激活因子（CREB、-连环蛋白）磷酸化、调控关键靶基因表达及类固醇合成方面都有更强更显著的作用。因此，FSH已被证明是最活跃最有效的糖型，这为以后长效rFSH 分子的设计提供了参考。

FSH 根据N-糖基化糖型及末端唾液酸组成的差异，衍生了4 种rFSH，被西方国家批准上市的有3 种，分别是Follitropin Alfa（Gonal-F）、Follitropin Bate（Puregon）和Follitropin Delta（Rekovelle,也 叫FE 999049），第4 种Follitropin Epsilop（Glycotope）还在III 期临床阶段。前2 种由中国仓鼠CHO 细胞系分泌，只含有-2，3-唾液酸，后2 种由人类PER C6 细胞系分泌，同时含有-2，3-唾液酸和a-2，6-唾液酸。不同的唾液酸类型可能会导致不同的体内清除率，肝脏去唾液酸糖蛋白受体（Asialoglycoprotein Receptor，ASGPR）对-2，6-唾液酸有很强的亲和力，会导致含-2,6-唾液酸的rFSH 以较快的速度被肝脏灭活，而-2，3-唾液酸则会阻滞ASGPR 的识别作用，2 种唾液酸按合适的比例添加可最大限度地发挥其作用。在啮齿动物中，肝脏ASGPR 的表达量显著高于人类，因此高-2，6-唾液酸含量的rFSH 在大鼠体内的效力估计不能准确地反映在人体中，这就导致Follitropin Delta 不能像其他3 种rFSH 一样按生物活力（IU）给药，而只能按质量（µg）给药。目前还没有报道公开指明rFSH、rFSH与这4 种rFSH 确切的关系，只有相关研究通过蛋白免疫印迹证明Gonal-F具有类似于FSH的糖型结构。

近30 年来，Follitropin Alfa 和Follitropin Bate 在临床上已被反复证明对体外受精（In Vitro Fertilization，IVF）/卵泡浆内单精子显微注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）的控制性促排卵（Controlled Ovarian Stimulation，COS）几乎有相同的临床效果。Follitro pin Delta 和Follitropin Epsilop 是最近几年开发的新rFSH制剂。在IVF/ICSI 患者中，10 µg/d Follitropin Delta剂量可提供与150 IU/d Follitropin Alfa 相似的卵巢反应。最近有研究依据抗缪勒氏管激素（Anti-Müllerian Hormone，AMH）和年龄的不同进行分组，比较个体化固定Follitropin Delta 给药方式与常规的Gonal-F给药方式是否有一样的效果，结果表明接受Follitropin Delta 治疗的女性有更显著的卵母细胞回收率、阳性HCG 率、临床妊娠率和活产率，不仅如此，Follitropin Delta 还可大幅度降低早期卵巢过度刺激综合征（Ovarian Hyperstimulation Syndrome，OHSS）和预防性干预的发生，并且也不会引起免疫原性与不良反应的增加。鉴于Follitropin Delta 突出的临床效果与安全性，Follitropin Delta 已被证明可广泛用于人类女性的不孕治疗中。Follitropin Epsilop 是一种全新的具有唾液酸残基类型优化的rFSH。在I 期临床试验中，Follitropin Epsilop 与Glonal-f有相似的安全性和药代动力学特性，并且在药效动力学（卵泡生长、抑制素B、E）方面，无论单剂量还是多剂量给药，Follitropin Epsilop 都能表现出明显的优势。II 期临床结果也表明，在长效GnRH 方案中，75 IU 的Follitropin Epsilop 可产生类似于150 IU Glonal-f的效果，112.5 IU Follitropin Epsilop 剂量诱导的激素水平（雌激素、抑制素B、孕酮）、优势卵泡数量和卵母细胞回收率等方面也比150 IU Glonal-f的诱导效果更显著。低剂量能产生更多的优势卵泡，这可能与高水平抑制素B 的表达有关，因为抑制素B 可以通过内分泌和旁分泌的方式参与优势卵泡的选择。尽管有关Follitropin Epsilop 的更多评估还在临床测试阶段，但依据目前的这些结果，仍可大胆推测Follitropin Epsilop 在妇女的辅助生殖中将是一种非常有前景的FSH 或uFSH 替代品。

2.2 O-糖基化 CG 是一种胎盘GPH，包含马绒毛膜促性腺激素，也叫孕马血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG），以及人绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，HCG），分别由马属动物和人胎盘绒毛膜细胞分泌，CG羧基末端有不同的延伸肽（Carboxyl-Terminal Peptide，CTP），其中人CTP 含有4 个O-糖基化，马属类CTP 含有12个O-糖基化。PMSG 是猪繁殖管理的常用产品，单次注射就能满足母猪发情排卵的需求。但PMSG 原料来源受限，提取纯化难度高且效价低，存在潜在的病毒传播风险，加之PMSG 天然含有FSH 和LH 2 种活性成分，且比例固定，无法将2 种活性成分分离，这限制了其应用范围。此外，PMSG 刺激后缺陷胚胎和OHSS 所占比例较高，因此，目前尚未允许PMSG 运用于人类，在动物中也不宜广泛运用，从而逐渐被rFSH所取代。

CTP 的存在延长了HCG 的半衰期，被截断的HCG117 不仅半衰期只有HCG-CTP 的三分之一，还丧失了HCG-CTP 独特的生物学活性。Fares 等利用基因重组技术成功制得FSH-CTP 和FSH-（CTP）2种二聚体，发现重组的FSH不仅不会影响FSH 的组装、分泌、受体亲和力、类固醇合成等能力，还能显著提升FSH 的半衰期（约3 倍）和诱导大鼠颗粒细胞产生更多雌激素（3～5 倍）。目前，唯一被批准上市的长效FSH制剂是Corifollitropin Alfa（CFA，也 叫Elonva），它利用基因重组技术把HCG-的CTP 融合到FSH的羧基端，然后再与亚基共转染CHO 细胞所得，这种FSH-CTP 可提供大约68 h 的人体内半衰期，能最大程度上增加不孕妇女的容受性。

单次Elonva给药完全可以替代每日rFSH 给药方案，甚至还可能产生更好的临床效果。虽然长效rFSH 的使用可能也会导致较高的OHSS 风险，但临床数据显示，在连续周期中使用Elonva不会引起OHSS、免疫原性反应、超敏反应等不良反应比率的增加，同时也不会降低患者的妊娠率，并且还具有良好的耐受性。Elonva给药也存在一定的灵活性，对于卵巢高反应者和正常反应者，Elonva推迟2 d 或4 d 给药不会影响卵母细胞的回收率和活产率，但卵巢高反应者可能会有较高的OHSS 风险，而对于卵巢反应不良者，为避免卵巢周期的消失，必须严格按时给药。另外，不同的COS 治疗方案可能会产生不同的临床效果。给予高龄低卵巢反应者rFSH 和Elonva治疗时发现，Elonva的长激动剂方案在所有的临床参数中，如卵母细胞回收率、受精率、胚胎移植率、持续妊娠率、怀孕率等，均显示出了最好的效果；与无Elonva拮抗组相比，Elonva短效拮抗剂方案虽有效果，但并不显著。然而，Elonva并非对所有的低卵巢反应者都有一样的效果，对于窦卵泡计数（Antral Follicle Count，AFC）>5 的患者，Elonva与每日促性腺激素一样有效，而对于AFC ≤5 的患者，其效果可能不如每日促性腺激素。因此，使用促性腺激素治疗卵巢反应不佳的妇女可能需要根据患者的即时身体状况而定，相同的给药方案很可能会导致不同的临床效果。另一个值得注意的方面是，患者的体重指数对于COS 的治疗也是至关重要，肥胖或高龄的女性可能需要更多的促性腺激素才能达到理想的临床效果，这就需要临床医生加强对OHSS 的监控，以避免严重不良反应的发生。

尽管FSH 主要应用于女性的辅助生殖，但近年也有针对男性特发性不育的报道。在雄性中，不同的rFSH 也可能导致不同的治疗效果。研究者通过体外评估不同rFSH 与睾酮组合对青年猪支持细胞的不同效果，辩证性得出Gonal-F可治疗低性腺激素引起的继发性生精功能减退，Follitropin Bate 可用于改善精子质量和治疗精子细胞的停滞，uFSH 可用于治疗正常性腺激素下的特发性不育症。长效Elonva也能用于人类男性性腺功能减退的治疗，相比常规rFSH 药物，Elonva不仅能有效维持内分泌水平趋于正常范围，还能显著增加睾丸体积和精子细胞数量，这表明Elonva在男性中也可以安全有效的替代每日rFSH 给药。

3 可结晶片段融合

在肝代谢和血液循环中，功能蛋白主要因脱离受体介质而被溶酶体识别降解，而机体循环中就存在一些内源性受体，可缓解功能蛋白的降解作用，如FcRn 受体。FcRn 受体普遍存在于内皮细胞、胎盘、肾脏、肝脏、肺等组织中，并通过pH 强依赖性与免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）的Fc 区结合，酸性环境下，FcRn 与Fc 区具有很强的亲和力，生理pH 下，FcRn对Fc 区亲和力降低，Fc 融合蛋白脱离FcRn 的保护而被免疫细胞识别，随后暴露于酶解系统中失活。在FcRn 的保护下，人血清IgG1、IgG2、IgG4 的半衰期可长达19 d 左右。Fc 融合蛋白就是利用Fc 与FcRn的亲和力来延长功能蛋白的循环半衰期。迄今为止，已有多种Fc 融合产品被批准用于人类疾病的临床治疗中。但FSH-Fc 融合蛋白目前主要用在畜牧生产中。

陈鸿雨通过小鼠毒性试验对广州威生医药科技有限公司批号为20160704 的FSH-Fc 融合蛋白的安全性进行了评估，证明了FSH-Fc 蛋白可重复大剂量给药且无毒性和致畸作用。KN015 是另一种FSH-Fc 融合蛋白异二聚体，通过基因融合技术让FSH与Fc 结构域融合，然后与FSH共转染CHO 细胞而产生。虽然KN015 体外试验显示出较差的药代动力学，但KN015在大鼠和食蟹猴体内可被缓慢吸收和降解，它有长于Glonal-F10～13 倍的体内半衰期，并且体内对卵巢增重、E水平、颗粒细胞增殖等的刺激优势显著强于Glonal-F，另外KN015 对大鼠优势卵泡的选择作用也更有优势。串联的Fc-FSH 能克服亚基组装和解离的局限性，Fc-gFSH-CTP-FSH就是一种猪FSH（Porcine FSH，pFSH）重组的高分子串联Fc 融合蛋白，包含CTP 和Fc 2 个半衰期有效延长的功能域，能被稳定分泌和表达，该rFSH 虽然有较长的半衰期，但在体外刺激鸡颗粒细胞增殖及其E分泌方面的效果并不及商业化的绵羊FSH 制剂。

FSH-Fc 融合蛋白目前尚未用于女性的不孕治疗，推测这可能与人类的卵泡周期有关。Fc 与FcRn 之间强的酸碱依赖性对于增强Fc 融合蛋白的半衰期和生物活性至关重要，研究人员已经通过合理设计和不同组合方法开发了多种具有增强pH 选择性的Fc 变体，这些变体对于治疗人类免疫病、病毒性疾病和癌症有很好的临床效果。为进一步获得信息量，未来可能需要开发更强大的体外分析系统来监测融合蛋白在血管循环中吸收与代谢情况，以便更加精准调控Fc 变体在结构上的细微变化，从而让Fc 融合蛋白在医学领域发挥强大治疗效果。

4 聚乙二醇化

PEG 与蛋白质、肽、寡核苷酸和纳米粒子的结合是一种成熟的技术，已被广泛用作生物偶联剂，可以保护功能蛋白免受肾脏的清除。Uchiyama 等首次对pFSH 进行化学修饰，pFSH 和PEG 的不同比例会导致不同的FSH-PEG 分子量和生物活性，体外试验表明pFSH 比PEG 以1:30 的比例对牛卵丘细胞扩张效果最好，但不能有效降低该蛋白的免疫原性。此外，由于PEG 的不可降解性和免疫原性，很可能会对肾脏和肝脏造成不同程度的损伤。

最近的一项研究显示，不可分解PEG 衍生物PEG的分子量增加可减轻甚至消除加速血液清除（Accelera ted Blood Clearance，ABC）现象和机体免疫反应，同时还可确保长的半衰期。这为以后FSH-PEG 药物的开发提供借鉴，可以通过调整PEG 的结构和分子量来避免原本PEG 可能会带来的种种弊端。因此，了解PEG 的特性对于研究者和临床医生开发和运用新型药物载体以确保最佳治疗效果是至关重要的。

5 结语

近年来，随着生物技术的快速发展与人类的需求，治疗性促性腺激素药物的运用已越来越广泛。然而，由于天然FSH 越来越受动物屠宰年龄以及组织材料来源的限制，加之常规rFSH 或uFSH 的治疗效果并不明显，这往往需要频繁给药才能维持卵泡发育或精子发生所需的有效阈值，因此开发新型rFSH 已成为辅助生殖药物研究的焦点。目前大多数rFSH 制剂主要用于畜牧业的育种工作中，如Fc-FSH、PEG-FSH 等，它们通过基因工程在体外重组，然后利用细胞工艺扩大生产，再通过蛋白纯化技术生产高纯度的rFSH 制剂，这与传统uFSH 相比，不仅成分单一、活性高，产品批次稳定性也好，而且还不含病毒微生物和内毒素，从而避免了疾病的传播。在欧美国家已有多种rFSH 成功上市，如Follitropin Alfa、Follitropin Bate、Follitropin Delta 和Corifollitropin Alfa，它们各有其特点，并都有显著的临床效果。Corifollitropin Alfa 是用于人类临床中唯一的长效rFSH 制剂，它可以代替常规rFSH 制剂7 d 每日1 次给药，但仍需要与其他促性腺激素配合使用才能维持人类10 d 左右的卵泡周期，并且很可能引发患者产生不良反应。总之，前人对辅助生殖技术已经做出了很多贡献，促性腺激素对整个生殖生理乃至整个机体的调控仍然是一个具有挑战的难题，未来对rFSH 的探索还有很长一段路要走。