基因缺失技术在动物疫苗中的研究应用进展

刘海霞，王艳晓，王磊

（1.天津瑞普生物技术股份有限公司 天津 300308；2.天津市农业生态环境监测与农产品质量检测中心 天津 300402）

我国是畜禽养殖业大国，我国畜禽养殖业的规模和数量均居全球首位，畜禽业为我们提供了丰富的畜产品。然而，动物疫病如禽流感、非洲猪瘟等对畜禽养殖业有着毁灭性的打击。同时，一些畜禽疫病还是人畜共患病，不仅危害畜牧业健康发展，还对人类公共卫生事业造成极大隐患。动物疫苗的发展极大地解决了动物疫病对畜牧业的危害。

随着基因组测序技术、蛋白质组学等学科的发展，基因缺失技术得到飞速发展。相较传统疫苗如：灭活疫苗、减毒活疫苗等而言，运用基因缺失技术研制的基因缺失疫苗有着可控、快速、高效等优点。本文就基因缺失技术的概念、主要技术手段及动物基因缺失疫苗研发及应用等做一总结，以期对基因缺失疫苗的研究提供参考。

1 基因缺失技术的含义

1953 年DNA 双螺旋结构被发现，人类进入分子生物学研究阶段。经过近70 年发展，已从研究DNA 中碱基序列排列规律发展到研究DNA 基因片段的遗传密码功能阶段。基因缺失技术正是研究DNA 基因片段的技术，就是将细胞（细菌或病毒）内的某些功能性基因片段通过DNA 同源或异源转化、重组去掉，从而改变细胞（细菌或病毒）遗传学特性的技术，它其实是基因工程技术中基因敲除技术的一个分支。

在动物疫苗的研制和生产中，通过基因缺失技术敲除掉动物疫病致病源（如：病毒等）DNA 序列中某些致病基因片段，构建一个缺失这些致病基因的疫苗株，而保留致病源的传染性，从而达到免疫疫病的作用。

2 基因缺失常用技术手段

CRISPR-Cas9 系统、TALEN 技术、ZFN 技术等基因缺失研究技术都是在近年发现DNA 基因片段特性的基础上发展起来的。2020年，CRISPR-Cas9 基因编辑系统获得诺贝尔化学奖，在动物疫苗的研发中已广泛应用。

2.1 CRISPR-Cas9 系统

CRISPR-Cas9 系统是规律成簇间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相关蛋白（clustered regularly interspaced short palin dromic repeats-associated proteins，Cas）的简称。

CRISPR-Cas9 系统是由两种蛋白组合而成，该系统主要通过蛋白酶将目的DNA 位点切割，可以使DNA 双链断裂。当同源序列存在时，断裂DNA 区间可以直接进行同源重组，进而定点敲除目的基因。当双链断裂端为非同源末端时，不同源序列可重新连接DNA 游离末端，进而实现基因敲除的目的，此种情况主要发生在真核生物。因此，CRISPR-Cas9 技术特点是通过不同的sgDNA 设计对基因进行定点修饰，并且对同源和非同源DNA 均可以进行基因缺失操作。它的主要优点是操作简单、识别位点选择多、试验周期较短、成本较低、快捷高效。

2.2 类转录激活子蛋白（TALEN）技术

TALEN 技术主要是由类转录激活子（Transcription activa tor-like effector，TALE）和DNA 内切酶（FokⅠ）两部分发挥作用。TALE 主要作用为识别并特异结合靶DNA，FokⅠ的主要作用为内切酶切割TALE 识别的DNA 位点。TALE 由四部分组成，分别是：迁移域（Translocation domain，TD）、DNA 特异识别结合域、核定位域（Nuclear localization signal，NLS）和激活结构域（Activation domain，AD）4 部分构成。其中，TALE 中部DNA 特异识别结合域是由一系列数目不定的串联重复氨基酸单元组成。每个重复单元只能识别1 个核苷酸。TALE 识别DNA 位点后，FokⅠ将DNA 链切割，通过基因敲除，将目标基因缺失。TALEN 技术的发明使得基因敲除的效率明显提高，因此，在小鼠、斑马鱼、拟南芥等基因工程研究热门物种中得到广泛应用。

2.3 ZFN 技术

ZFN 由锌指蛋白（ZFP）和DNA 内切酶（FokⅠ）两部分组成。该技术的原理是：ZFP 识别并特异结合目标DNA 序列，FokⅠ切割目标DNA。细胞再通过非同源类末端接合或同源重组等方式对目标基因进行修复，改变目标DNA 序列，从而达到基因敲除的目的。ZFP 一般是由3～6 个锌指结构域串联组成，多个锌指结构的优点在于可识别较长的目标DNA 序列，而发挥切割作用至少需要两个FokⅠ形成的二聚体，在二聚体的中间切割DNA。

ZFN 是第一代人工DNA 内切酶技术，与传统的DNA 干扰技术相比，ZFN 技术提高了基因组的编辑效率，操作简单，可以快速敲除目的基因。

2.4 Cre/LoxP 系统/FLP-FRT 系统

Cre/LoxP 系统由大肠杆菌噬菌体的Cre 重组酶和LoxP 位点两部分组成。Cre 重组酶蛋白可以切除同向重复的2 个LoxP 位点内的DNA 片段。该系统的原理是：在Cre 基因启动子的诱导下，Cre 重组酶蛋白得以表达，进而将LoxP 位点之间的基因切除。研究者可以通过对诱导剂诱导时间的控制，调节编码Cre/LoxP 系统在转移到动物体内后，再进行识别动物的组织细胞中LoxP 位点，实现控制该系统在正确的点位进行基因敲除。

FLP-FRT 系统[FLP 重组酶-FLP 识别目标（Flp recognition tar get，FRT）]的作用机理与Cre/loxP 系统的机理类似，FLP 也是位点特异的重组酶，再通过FRT 在FLP 识别位点对基因进行切割再链接，使目标基因得以缺失。与TALEN 技术和ZFN 技术相同，这些技术都需要特异性识别、切割蛋白系统。

2.5 Red 同源重组技术

Red 同源重组技术主要是在表达质粒上来实现的。在表达质粒上的含有Red 重组酶的exo、beta 和gam 这3 种基因，exo和beta 基因表达后形成两种蛋白，它们偶联结合形成复合物，特异性的识别外源基因并与之结合，与宿主细菌的染色体上的同源基因发生重组，而gam 的表达蛋白作用是抑制宿主细菌特异识别降解外源DNA，达到保护外源插入目的基因的目的。整合到宿主细菌后，质粒再通过同源重组将带有宿主DNA 的片段切除，达到基因缺失的目的。

3 基因缺失动物疫苗研发及应用

3.1 猪基因缺失疫苗的研发

猪是我国畜牧业最主要的养殖动物。近年来，养猪业遭受非洲猪瘟（African swine fever，ASF）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪圆环病毒2（porcine circovirus type 2，PCV2）等致病微生物的侵袭，给我国养猪业带来巨大损失。目前，借助基因缺失技术研究猪用疫苗取得很多进展。

张艳艳等将我国首例非洲猪瘟疫情中分离的流行毒株（SY18）作为亲本株，运用同源重组缺失技术筛选构建了ASF 病毒中的免疫抑制（MGF）基因和（CD2V）基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗候选株，试验结果显示MGF 和CD2V 双基因缺失株（ASF SY18ΔMGF／ΔCD2V）对猪安全，接种猪能够100%抵抗亲本强毒株SY18 株的攻击，可以作为非洲猪瘟疫苗候选株。唐雯利用CRISPR/Cas9 技术结合同源重组技术对PCV2 和伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）的四个基因位点敲除后，找到TK-/gE-/gI-/Cap+重组伪狂犬病毒株，这为开发二联PCV2/PRV二联疫苗奠定了基础。

3.2 家禽基因缺失疫苗的研发

家禽养殖周期短，蛋和肉产品是百姓餐桌上常见的食品。但是家禽的许多疾病具有传播快、变异快的特点。而且多种禽流感病毒还是人畜共患病的致病因素，为预防增加了难度。家禽的基因缺失疫苗在多致病病源上都取得突破。

杨森等利用鸡马立克病病毒（MDV）在疫苗株和强毒株之间具有明显的序列差异性这一特点。运用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，以MDV 疫苗株meq 基因为靶点，设计合成gRNA，克隆构建pX459-gRNA 质粒，成功构建出1 株meq 基因缺失毒株（CVI988Δmeq-C7），为后续筛选和鉴定抗MDV 疫苗株奠定了基础。Zou 等研制出一种同时对鸭肠炎病毒（DEV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1 均有效的新型疫苗，这项研究利用CRISPR/Cas9 介导的基因编辑系统，高效地获得了同时编码HPAIV H5N1 血凝素（HA）基因和膜前蛋白（PrM）基因以及DTMUV 包膜糖蛋白（E）基因的DEV 重组蛋白。DEV 重组蛋白对H5N1 和DTMUV 均有较强的体液免疫和细胞免疫应答，对H5N1、DTMUV 和DEV 均有较强的保护作用。此项研究首次证明CRISPR/Cas9 系统能够快速、高效地对DEV 基因组进行改造，重组缺失病毒株可以作为一种潜在的鸭传染性胃肠炎三价疫苗来预防H5N1、DTMUV 和DEV 感染。

3.3 牛、羊基因缺失疫苗的研发

牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV-1）可引发牛传染性鼻气管炎，对养牛业造成巨大经济损失。穆艳霞应用CRISPR/Cas9 基因编辑与同源重组技术，构建带有增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluo rescent protein，EGFP）标记并缺失E 糖蛋白（glycoprotein E，gE）的重组BHV-1 病毒（BHV-1 gE/EGFP）。这项研究探索了利用CRISPR/Cas9 系统进行BHV-1 gE 基因的缺失编辑，为构建高效的BHV-1 基因缺失毒株提供了一种思路，为今后基因缺失疫苗的研制提供依据。

羊传染性脓疱（Contagious ecthyma，CE）是由羊传染性脓疱病毒（Orf virus，ORFV）引起的一种急性人兽共患传染病。周帅帅利用同源重组技术构建ORFV-SY17 株122 基因缺失病毒株（OR FV-SY17△122），经过验证基因缺失株的复制能力得到明显削弱，为研发ORFV 疫苗提供理论基础。

3.4 其它养殖动物基因缺失疫苗的研发

水产养殖疫苗是近年新兴的一类疫苗，区别于传统的消毒剂和抗菌药，可以减少水产品中的药物残留。杀鱼爱德华氏菌（Ed wardsiella piscicida）是一种常见水生致病菌，它感染范围广，传染能力强，对水产养殖业行业危害巨大。周鹏运用同源重组的基因敲除方法将该菌crp 基因敲除，获得Δcrp 基因缺失株，试验表明crp 基因缺失菌毒力显著下降，具有进一步开发为减毒活疫苗的潜质。

4 展望

基因缺失技术发展到今天已经经过三代，随着科学家对各种生物体基因组特性的深入了解，必定会找到更加先进的DNA 识别和酶切组合，目前应用较多的是CRISPR-Cas9 系统，已经在动物疫苗的研究中广泛应用。基因缺失动物疫苗与传统的动物疫苗相比，该项技术可以精确地将病原基因敲除，操作简便，成本较低。基因缺失疫苗具有免疫标识，利用缺失的基因可以进行野生型感染和疫苗免疫的诊断，已成为新型疫苗研究开发的主流。

但是，目前也有关于基因缺失疫苗返毒突变为强毒株的报道，随着基因缺失技术的不断完善，基因缺失疫苗会成为研究新型动物疫苗的有效手段之一。