治疗血友病的新策略：抑制抗凝系统

李天逸（Li Tian-yi），江淼（Jiang Miao），夏利军（Xia Li-jun）

（苏州大学附属第一医院 江苏省血液研究所，国家血液系统疾病临床医学研究中心，国家卫生健康委员会血栓与止血重点实验室，苏州 215006

1 背景

在生理性止血中，凝血系统和抗凝系统之间的动态平衡至为关键（图1A）。一旦这种平衡被打破都会导致机体出血或血栓形成。血友病患者缺乏促凝血因子FⅧ或FⅨ，止血的平衡向出血倾斜（图1B）。替代治疗主要是通过补充体内缺乏的凝血因子（FⅧ或FⅨ）恢复止血平衡，其主要包括两种方式：按需治疗及预防治疗，按需治疗指有明显出血时给予的治疗，预防治疗则是以维持正常关节和肌肉功能为目标的规律性替代治疗。目前国际上血友病的治疗已转移到以预防治疗为主［1］。为了解决血浆源性凝血因子制剂和重组凝血因子制剂半衰期较短的问题，融合蛋白类药物和化学修饰类长效人凝血因子药物已成功上市，它通过减少预防性给药次数来减轻患者负担并提高患者的依从性［2］。但在临床实践中由于受到血管性血友病因子半衰期的影响，该类药物半衰期延长效果并不理想。且由于输注凝血因子而导致抑制物产生的问题仍未得到解决。艾美赛珠单抗是一种新型的非凝血因子药物，它是一种人源化双特异性抗体，通过模拟FⅧ辅因子功能，与FⅨa 和FⅩ识别并结合形成稳定复合体，进而促进凝血酶的生物合成以促进机体凝血功能的恢复［3］。它与FⅧ在结构上没有同源性，因此不会诱导抑制FⅧ的作用，也不会被现有的FⅧ抑制剂抑制。该药仅需每周皮下注射1 次，显著地改善了患者的负担，提高了患者的生存质量，是血友病A 治疗的重要突破性进展［4］。最近的血友病基因治疗临床试验已经证明，一种新型的表达高活性Padua 因子Ⅸ（FⅨ）蛋白的基因工程肝脏靶向腺相关病毒载体（BBM-H901）已被开发出来，有望用于血友病B 的基因治疗［5］。尽管目前的临床试验取得了积极的结果，但基因治疗有着伦理和价格不菲的问题，整合过程中存在基因毒性、脱靶效应和致瘤风险，其转染和编辑的效率也有待商榷［6］，这可能会影响这种方法的广泛使用。上述这些血友病治疗的重点都是基于对缺失的凝血因子的替代以恢复止血的平衡。（图1C）近来，抑制抗凝通路来恢复止血平衡受到了关注，已有证据表明即使不补充缺失的凝血因子，通过抑制／减少体内生理性的抗凝物质也可以恢复止血平衡（图1D）［7］。抑制活化蛋白C（APC）是治疗出血性疾病的最新靶点，该靶点不仅有望改变我们治疗血友病的方法，还将改变许多其他出血性疾病的治疗方法。

图1 血友病治疗机制

2 抑制APC 通路作为血友病治疗的新策略

2.1 APC 的生物学功能

蛋白C（PC）是一种维生素K 依赖的血浆糖蛋白酶，主要在肝脏中产生。在凝血酶-血栓调节蛋白（T-TM）复合物作用下产生活化蛋白C（APC），内皮细胞蛋白c 受体（EPCR）通过结合蛋白C 并呈递T-TM 复合物进一步加快APC 的形成。APC 通过以下方式发挥其生物学功能（1）APC 在PS 等辅助因子的帮助下在带负电荷的磷脂膜上发挥其抗凝血活性灭活FⅤa 和FⅧa，从而影响FⅧa-FⅨa 复合物和FⅤa-FⅩa 复合物的生成，导致凝血酶的生成减少。（见图2）（2）抑制纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）的活性和凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI），进而诱导t-PA 的释放，从而激活纤溶系统［8］。除了其关键的抗凝作用外，APC 可以直接抑制炎症介质的释放而发挥直接抗炎作用或通过EPCR 依赖性方式发挥间接抗炎作用。当APC 与EPCR 结合激活蛋白酶活化受体-1（PAR-1）时，它还能显示出抗细胞凋亡的作用。这些细胞保护功能包括抗炎、抗凋亡和神经保护活性以及保护内皮屏障功能［9］。

图2 蛋白C 途径及抗APC 抗凝活性药物作用机制

FⅤLeiden 突变c.1691G＞A（Arg506Gln）是导致血栓形成的最常见原因。激活的FⅤ需要在该Arg 位点被APC 切割才能被有效灭活，因此该位点的突变会诱使机体产生APC 抵抗，诱发血栓的形成［10］。在血友病A 合并FⅤLeiden 杂合突变的患者体内，这种促血栓形成突变，可能部分补偿血友病患者较低的FⅧ或FⅨ水平，导致更有效的凝血酶生成，从而减轻患者的出血症状。此外，有体内研究表明FⅤLeiden 突变改善了血友病小鼠模型的出血表型［11］。这为人类抑制活化蛋白C（APC）活性重新平衡止血来治疗血友病A 提供了证据。

2.2 APC 的丝氨酸蛋白酶抑制剂

APC 的内源性抑制剂包括蛋白C 抑制剂（PCI）、α1-抗胰蛋白酶（α1AT）等，但是它们对APC的反应性和特异性都较差［12］。为了获得强效且具有特异性的APC 抑制剂，Polderdijk SG 等人设计了一种以α1AT 基因Pittsburgh 突变为模板的α1ATRCL-Lys 变异体。该突变体用Lys 取代了反应中心环（RCL）裂解位点周围的氨基酸（P2 位的Pro 和P1’位的Ser）。这种名为serpinPC 的APC 抑制剂被证明能以剂量依赖的方式增加体外凝血酶的生成，在B 型血友病小鼠体内注射后，可诱导的损伤后的血凝块形成，并在夹尾试验中减少失血［13］。SerpinPC 具有潜在的较长半衰期，可以特异性和快速地抑制APC，并可以皮下给药。ApcinteX 公司宣布了该药物在2a 阶段的一些研究成果，在每四周皮下注射3 种剂量的SerpinPC（0.3、0.6、1.2 mg／kg）的情况下，随访观察24 周后，结果显示最高剂量下所有出血的中位数减少了88%（从36.0 减少到4.4），自发关节出血的中位数减少了94%（从21.1 减少到2.2）。未发现静脉血栓栓塞症或其他相关不良反应［14］。

2.3 抑制APC 抗凝活性的特异性抗体

APC 的抗凝和抗细胞凋亡的活性位点位于其不同部位，且血浆中PC 的浓度是APC 的1700 倍，因此在血友病中针对APC 通路止血的抗体不仅需要特异性的结合APC 而不影响循环PC 水平，而且必须选择性的抑制APC 的抗凝活性并不影响细胞保护活性。HAPC1573 抗体是一种抗人APC 的单抗，其已被证实除了具有上述功能外，还可增强APC 与EPCR 的结合，该结合可能增强了APC 与EPCR 结合PAR-1 所介导的细胞保护功能［15］。在一项研究中，Zhao XY 等人［16］发现HAPC1573 结合到一个包含已知的APC-FⅤA 接口的APC 的自溶环上。HAPC1573 可能通过干扰APC 和FⅤA 之间的相互作用来抑制APC 的抗凝功能。此外，他们在急性获得性血友病A 的猴子模型中证明了人源化的HAPC1573 止血的有效性和安全性。然而该模型与人类慢性血友病模型有很大的不同，为了证实HAPC1573 在人类慢性血友病模型中的有效性，Jiang Miao 等人［17］利用基因工程技术，将小鼠的PROC 基因替换为人类PROC 基因，由此获得了表达人蛋白C 的血友病小鼠。他们在该小鼠的剪尾出血模型和针刺诱导的膝关节出血模型中发现，HAPC1573 能够使小鼠尾部的出血时间正常化，有效地缓解了膝关节肿胀症状，且与未经处理的小鼠相比，出血显著减少。此外，他们还发现在蛋白C激活的情况下HAPC1573 能以剂量依赖的方式改善缺乏Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ和VWF 的人血浆的凝血时间，HAPC1573 在其最大抑制作用下并不能缩短没有蛋白C 激活的情况下的由各种凝血因子缺乏所导致的APTT，这些研究结果表明该疗法不仅可以治疗FⅧ或FⅨ缺乏的患者，还可以运用于其他类型凝血因子缺乏的患者的治疗当中，且HAPC1573 抑制APC 的抗凝活性几乎没有血栓副作用的风险。

早期的研究表明，抗体MPC1609 可能与PC／APC 的GLA 结构域（与EPCR 和磷脂结合所必需的结构域）结合，抑制APC 的抗凝和细胞保护活性，抗体MAPC1591 可能是通过干扰APC 与其底物FⅤa的结合而不干扰其与内皮的结合，仅表现出抑制APC 的抗凝活性［18］。Jhansi Magisetty 等人［19］利用上述两种单抗及对照IgG 注射入FⅧ-／-小鼠体内，通过监测关节出血及关节直径的变化，以及对关节组织切片进行组织病理学分析来评估血友病性关节病。与MPC1609 相比，MAPC1591 可以防止关节复发出血。减少关节内再出血将阻止关节中铁的积聚、炎症、肥大和新血管生成的恶性循环，从而阻止血友病性关节病的发展。

这种利用抑制APC 的抗凝功能的特异性单抗治疗血友病的非凝血因子疗法，与传统的替代疗法相比，其具有很长的半衰期，且具有皮下输注的潜力，可提高患者的生存质量。由于其特异性的抑制APC 的抗凝活性，不影响细胞保护功能，因此具有一定的安全性。此外，用于治疗血友病的因子或非因子替代疗法如果使用不当，可能会有血栓副作用的风险。而该抗体已被证明几乎没有血栓副作用的风险，也不会导致抑制物的产生，还可以有效的预防血友病性关节病的发展。因此该类药物具有广泛的治疗前景，可被用于血友病的治疗。

2.4 EPCR mAb 抑制依赖EPCR 的APC 信号转导和APC 的产生

早期的研究表明FⅦa-EPCR 的相互作用可能有助于FⅦa 在血友病治疗中的止血作用［20］。同时药理浓度的人rFⅦa 被证明在人内皮细胞模型系统中下调EPCR 介导的蛋白C 的激活。Keshava S 等人［21］通过给野生型、EPCR 缺陷和EPCR 过表达的小鼠注射FⅧ单抗（1 mg／kg）构建了3 种不同的获得性血友病小鼠模型。与野生型所构建的获得性血友病小鼠相比EPCR 缺陷的获得性血友病小鼠的平均止血时间显著减少，在此基础上给予0.25 mg／kg 的rFⅦa 可使EPCR 缺陷的小鼠模型的平均止血时间恢复至野生型小鼠水平，而野生型获得性血友病小鼠则需1 mg／kg 的rFⅦa 才能完全纠正出血表型。此外，在过表达EPCR 的小鼠，即使给予4 mg／kg的rFⅦa 也不能完全纠正该组的出血表型。此项研究证明，rFⅦa 在血友病治疗中的止血作用不仅来自于FⅦa 对FⅩ的激活，还通过与蛋白C 竞争EPCR，从而抑制EPCR 介导的APC 的产生和依赖EPCR 的APC 信号转导。rFⅦa 在过表达EPCR小鼠中止血效果降低的原因可能是初始凝血酶生成后产生的APC 水平的增加所导致［21］。FⅦ-EPCRPAR1 诱导的信号转导可保护血管内皮生长因子（VEGF）诱导的屏障通透性以及细胞因子和脂多糖（LPS）诱导的炎症且炎症和血管通透性在血友病性关节病的发病机制中起关键作用［22］。因此，阻断EPCR 除了可以下调APC 的生成影响血友病的出血外，还可能影响血友病患者的关节损害。该观点在EPCR 缺陷的血友病小鼠模型中得到证实，EPCR缺陷显著降低了血友病滑膜炎的严重程度。且单剂量注射阻断EPCR 的单抗也可达到类似的效果［23］。除了EPCR 的胚胎外表达可能是胚胎存活所必需的，没有其他证据表明EPCR 对健康是必要的，在一项脂多糖诱导的体内炎症反应的实验中，EPCR 缺陷小鼠和WT 小鼠的炎症程度没有显著差异。且在过去对EPCR 缺陷的小鼠进行的观察中，没有发现健康相关的问题［24］。因此，注射EPCRmAb 来预防血友病性关节病不太可能对血友病患者的健康产生任何负面影响，综合考虑EPCR 抗体在减少关节出血和血友病滑膜炎方面的效果，EPCRmAb 抑制依赖EPCR 的APC 信号转导和APC 的产生是治疗血友病的一个潜在靶点。

3 抑制其他抗凝通路的最新研究结果

3.1 TFPI 抑制物（组织因子途径抑制物抑制剂）

作为机体重要的生理性抗凝蛋白，TFPI 是组织因子（TF）、FⅦ和FⅩ的抑制物。抑制TFPI 已被证明可以减少多种血友病动物模型的出血［25］，在多种抑制TFPI 的策略中，Concizumab 正处于临床研究的第三阶段，它是一种高亲和力、人源化的抗组织因子途径抑制物的单抗。Concizumab 阻止了TFPI 对FⅩa的抑制和对TF／FⅦa 的抑制，从而在血友病患者缺乏激活的FⅧa ／ FⅨa 复合体的情况下产生足够数量的FⅩa 以确保有效止血［26］。然而Concizumab 的治疗监测难以捉摸，可能是通过凝血酶原时间或组织因子依赖分析来调查残留的TFPI 活性，因此需要对治疗监测进行进一步的研究。在该药物的第二阶段临床研究中，explorer4 和explorer5 试验评估了每日一次皮下注射Concizumab 的疗效和安全性，结果表明在至少76 周治疗后，以末次剂量水平估计的年出血率（annualized bleeding rate，ABR）为1.8 和2.1。且Concizumab 预防通常具有良好的安全性和免疫原性，尽管25%的患者产生抑制性抗体，但大多数是低滴度和短暂的，未观察到临床效应。［27］。

3.2 siRNA 靶向沉默抗凝血酶

AT 是一种天然抗凝血剂，是凝血酶和Ⅹa 因子的主要内源性抑制物。在一项研究发现两个严重血友病A（FⅧ＜1%）合并AT 缺乏症的个体，其表现为轻度出血表型。基于这种现象，抗凝血酶抑制剂可作为一种新的治疗方式应用于血友病的治疗［28］。在血友病小鼠中，靶向AT 的SiRNA 可延长血友病小鼠的生命。Fitusiran 是一种皮下注射siRNA，专门针对抗凝血酶（AT）的信使RNA 以降低肝脏中AT 的产生，从而增加凝血酶的生成，减少出血频次。这种药物仅需每月皮下注射1 次，对血友病A 和B的患者（包含伴抑制物者）有着相似止血改善［29］。在该药物的早期临床试验中，因一名HA 患者在将Fitusiran 与FⅧ联合使用后发生了致命的脑静脉窦血栓形成而被叫停，重新修改试验方案后才得以继续进行。考虑到该药物同时也存在突破性出血和血栓并发症等风险，仍需要进一步的剂量方案的优化［30］。在近期发布的两项3 期临床研究中表明，与按需CFC（凝血因子浓缩物）治疗相比，每月一次皮下注射Fitusiran 的血友病患者的ABR（年出血率）显著降低，且患者的健康相关生活质量得到显著改善［31］。

3.3 siRNA 靶向沉默蛋白S

蛋白S（PS）是一种抗凝血剂，它不仅在FⅤa 和FⅧa 失活的过程中作为APC 的辅助因子，还在抑制FⅩa 的过程中作为TFPI 的辅助因子。这种双重作用使PS 成为凝血酶生成的关键调节因子。Raja Prince 等人［32］利用PROS1 缺陷的血友病小鼠和PS被抑制（注射中和抗体或PS siRNA）的血友病小鼠以评估抑制PS 对血友病出血的改善情况，结果显示抑制PS 可部分限制鼠尾出血，但不能完全消除。此外，PS 缺陷或抑制PS 还提供了对血友病性关节病的完全保护。在凝血酶生成试验中，PS 抑制可使血友病A 患者血浆凝血酶的生成能力得到恢复。由于PS 在人血浆中以游离蛋白和与C4b 结合蛋白（C4BP）结合形成复合体的两种形式存在，PS 的沉默将会有影响C4BP 和人类的补体系统的可能性。此外，作为酪氨酸激酶受体（TAM 受体）家族的配体和激活剂，PS 具有调节免疫反应并刺激凋亡细胞吞噬的作用［33］。因此沉默PS 有影响该功能的风险，其可行性仍需进一步研究。

4 总结与展望

长久以来血友病的治疗是以替代治疗为主，但其存在患者依从性差，生活质量严重下降以及抑制物产生等问题。近些年来，基因治疗与新型药物的开发成为了治疗血友病的热点，尽管基因治疗已经产生了令人振奋的结果但由于其免疫原性和生物安全性问题，仍需进一步的研究。因此，新型药物仍需不断地开发。近来，抑制抗凝通路来恢复止血平衡受到了关注，其中抑制APC 是治疗出血性疾病的最新靶点，该类药物具有广泛的治疗前景，未来或许是治疗血友病和其他凝血因子缺乏疾病的一种新型的、有前途的治疗策略。

作者贡献声明李天逸负责撰写文章；江淼、夏利军负责修改文章和指导研究

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突