猪群中牛病毒性腹泻病毒的流行病学调查

陶 洁,李本强,程靖华,石 迎,刘惠莉

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海市农业遗传育种重点实验室,上海市种猪工程技术中心,上海 201106)

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)主要感染牛,引起以腹泻、流产、免疫抑制和持续感染等为主的临床症状,给牛群带来了很大的危害[1]。由于牛群中BVDV普遍存在,导致以胎牛血清为主的牛源性生物制品中BVDV污染严重[2-4],增加了猪用疫苗的潜在危害。猪是BVDV的易感宿主之一,各年龄段的猪均易感。目前,国内外猪群中BVDV感染情况屡见不鲜[5-7],有逐渐增长的趋势。BVDV和猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)属于同一个病毒属,猪群中BVDV抗体对猪瘟病毒有一定的抑制作用,会干扰猪瘟疫苗的免疫,降低猪瘟疫苗的免疫效果。此外,BVDV可导致机体免疫抑制,普遍降低猪群免疫力,从而增加其他病原的感染风险,造成临床疾病的复杂化[8]。因此,BVDV感染给猪群造成了较大的间接危害,应重视该病原的防控工作。

本研究对2017—2020年间上海地区猪群中BVDV的流行情况进行调查,从年度流行趋势、季节流行情况、不同猪场流行情况等方面进行分析,旨在了解目前BVDV的感染情况,为猪场有效做好防控工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DL2000 DNA Marker、TRIzol、Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、5×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer、Recominant RNase Inhibitor、dNTP Mixture(2.5 mmol∕L)均购自日本TaKaRa公司;磁珠法粪便RNA提取试剂盒购自上海医脉赛科技有限公司。

1.2 样品来源

在2017—2020年间从上海崇明、金山、浦东等地区6个猪场,分不同季节共采集仔猪腹泻粪便样品1 078份,各年度采样数量分别为134份、235份、584份和125份。

1.3 磁珠法提取总RNA并反转录

取适量采集的粪便样品悬浮于500 μL PBS中,振荡混匀,室温静置10 min;吸取上清,-40℃保存,用于提取总RNA。

按照磁珠法粪便RNA试剂盒说明书,提取粪便样品总RNA,反转录成cDNA,用于后续PCR扩增。

1.4 RT-PCR检测样品中的病毒性腹泻病原

首先,以cDNA为模板,利用BVDV Npro特异性引物进行PCR检测,确定样品中BVDV的阳性率。然后,以BVDV阳性的样品为模板,利用四重RT-PCR方法[9],检测样品中猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)的感染情况;同时利用七重RT-PCR方法[10]检测样品中的猪星状病毒(PAstV)、猪嵴病毒(PKoV)、猪萨佩罗病毒(PSV)、猪捷申病毒(PTV)、猪札幌病毒(PSaV)、猪环曲病毒(PToV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV);确定样品中BVDV与其他腹泻病原的混合感染情况。

1.5 上海地区猪群中BVDV的流行模式

统计所有样品的PCR检测结果,明确2017—2020年BVDV的阳性率,以及BVDV与其他腹泻病原的混合感染率,分析上海地区猪群中BVDV的流行趋势及感染模式。

1.6 不同猪场BVDV的流行差异

按照不同猪场统计所有样品的PCR检测结果,明确各猪场中BVDV的流行情况,结合各猪场的养殖、管理等情况,分析导致这种流行差异的原因。

1.7 不同季节BVDV的流行情况

按照采样的不同月份,统计所有样品的PCR检测结果,明确不同月份BVDV的流行情况,分析不同季节BVDV的流行规律。

2 结果与分析

2.1 不同年度猪群中BVDV的流行情况

利用BVDV特异性检测引物对2017—2020年采集的1 078份粪便样品进行RT-PCR检测,结果显示:共检测出77份BVDV阳性样品,总阳性率为7.14%。2017—2020年BVDV的阳性率分别为0.75%(1∕134)、7.66%(18∕235)、9.42%(55∕584)和4.80%(6∕125)。2017—2019年,上海猪群中BVDV检出率呈逐年递增的趋势,而2020年BVDV检出率有所回落,可能与该年度采样量较少有一定关系。

2.2 BVDV与其他腹泻病原的混合感染情况

利用实验室建立的四重RT-PCR和七重RT-PCR方法,进一步对这77份BVDV阳性样本进行其他腹泻病原筛查。结果发现:BVDV与其他腹泻病原的混合感染情况较严重,占51.95%(40∕77);且混合感染模式比较复杂,二重感染占65%(26∕40),三重感染占25%(10∕40),四重感染占10%(4∕40)。

进一步分析BVDV的混合感染模式(图1),结果显示:BVDV分别与PAstV、PEDV、PKoV、PSV和TGEV发生了二重感染(图1A),其中BVDV∕PAstV混合感染占比最高,其次为BVDV∕PEDV、BVDV∕PSV和BVDV∕TGEV。

BVDV与其他腹泻病原的三重感染中出现了5种不同的混合感染模式(图1B),其中BVDV∕PAstV∕PKoV混合感染占比最高,其次是BVDV∕PEDV∕PAstV混合感染,其余3种混合感染模式BVDV∕PEDV∕PKoV、BVDV∕PAstV∕PDCoV、BVDV∕PEDV∕TGEV的占比相等。

BVDV与其他腹泻病原的四重感染中(图1C)出现了3种混合感染模式,其中BVDV∕PEDV∕PAstV∕PSV混合感染占比最高,其余2种混合感染模式BVDV∕PKoV∕PAstV∕PSV、BVDV∕PSaV∕PToV∕PKoV的占比相等。可见,上海地区猪群中BVDV与其他腹泻病原的混合感染模式较复杂。

图1 BVDV不同的混合感染模式Fig.1 Different mixed infection modes of BVDV

2.3 不同季节猪群中BVDV的流行情况

根据样品采集时间(图2A),统计不同月份BVDV的阳性率,其中5月、6月和8月未检出BVDV,4月BVDV阳性率最高,其次是9月。整体而言,后半年BVDV阳性率较前半年高。

按季节分析(图2B),发现春季(3月、4月、5月)和秋季(9月、10月、11月)BVDV检出率较高,而夏季(6月、7月、8月)和冬季(12月、1月、2月)BVDV检出率较低。可能是由于春秋两季处于气温冷热交替的节点,群体抵抗力较弱,更容易诱发BVDV感染。

2.4 不同猪场BVDV的流行情况

根据样品采集地点,统计分析不同猪场BVDV的流行情况,发现有3个猪场未检测到BVDV,另3个猪场均有BVDV的流行。其中,猪场4中BVDV的检出率最高,达24.07%(13∕54);猪场2和猪场6中BVDV检出率分别为5.68%(44∕775)、13.54%(13∕96)。这可能与各猪场的养殖环境、管理模式及免疫现状密切相关。

2.5 猪场2中BVDV的感染情况

猪场2是本课题组长期监测病毒性腹泻病原的一个养殖场,2017—2020年间共采集仔猪粪便样品775份。结果显示:2017—2019年BVDV阳性率分别为2.5%(1∕40)、3.18%(5∕157)和8.61%(42∕488),呈逐年递增的趋势;而2020年BVDV检出率为6.67%(6∕90)。BVDV阳性率的趋势可能与年采样量有一定关系。

进一步分析该猪场BVDV的混合感染情况,结果显示:二、三、四重感染率分别为57.58%(19∕33)、21.21%(7∕33)、21.21%(7∕33)。二重感染以BVDV∕PAstV(57.89%,11∕19)感染模式为主,三重感染以BVDV∕PAstV∕PSV(85.71%,6∕7)为主,四重感染以BVDV∕PAstV∕PSV∕PSaV(71.43%,5∕7)为主。可见,该猪场BVDV的感染情况比较复杂。

3 讨论

世界动物卫生组织将BVD列入必须报告的动物疾病名录,但仅仅是牛报告疾病名录,这就容易让人们忽略BVDV还可引起猪等其他动物感染发病[11]。猪感染BVDV后表现出类似慢性猪瘟的临床表征,增加了临床中猪瘟的鉴别诊断难度。近年来,养殖环境、生产管理及疫病免疫等因素的不可控性,导致临床病原感染模式日益复杂,疾病诊断难上加难。

本研究对上海地区猪群中BVDV的感染情况进行了摸查,发现2017—2019年间猪群中BVDV感染有逐年递增的趋势,但2020年BVDV检出率有所下降,这可能与之前非洲猪瘟的暴发以及今年疫情的发生有一定关系,由于样品采集量的下降,间接导致BVDV检出率较之前低。但总体还是能说明猪群中BVDV感染不可忽视,特别是BVDV与其他腹泻病原的混合感染情况较复杂,主要以BVDV∕PAstV二重感染为主,在此感染模式基础上,继而发生三重感染、四重感染。近年来,猪群中PAstV检出率呈上升趋势,但其临床致病性表现不明显,对猪群的危害尚无法预判[12-13]。本研究室前期数据证实,PAstV与PEDV、PSaV等病原的混合感染也相当严重,推测可能存在协同致病性。而BVDV可导致持续感染、免疫抑制等,因此BVDV与PAstV、PEDV等病原的混合感染,无疑增加了猪群的疫病防控难度。

进一步分析发现,BVDV在春、秋两季的阳性率明显高于夏季和冬季,存在着一定的季节流行规律。可能是由于春秋季处于气温变化的交叉点,早晚温差大,容易导致猪群抵抗力下降,因而仔猪更容易感染BVDV。所以,在这两个季节要注意猪舍的保暖措施。此外,发现各养殖场的管理对BVDV感染存在较大影响,猪场1是全封闭型自动化养殖场,管理规范,BVDV检出率为0;而猪场4管理较欠缺,外人随意进出猪舍,无固定饲养人员,饲喂设施也较差,BVDV检出率高达24.07%。猪场2是本课题组的一个腹泻病原持续监测点,前期发现以PAstV、PKoV、PEDV为主的腹泻病原检出率一直较高,因此本研究监测了BVDV的感染情况,发现该猪场仔猪感染BVDV的情况也一直存在,而且混合感染模式也较复杂,仔猪最多同时感染4种腹泻病原。这也与该猪场的养殖环境和管理水平等有一定关系。该猪场猪舍设备较陈旧,养殖人员更换频繁,药物和疫苗使用过多,疫苗免疫程序时常调整,缺乏科学性。因此,在免疫防控的同时,养殖场的管理水平需有效提升,提高生物安全措施。

BVDV感染猪群的途径除了与牛群直接或间接接触以外,最重要的是目前使用的疫苗等生物制剂的潜在污染性[14]。因此,在购买这些猪用生物制剂时,一定要选择正规渠道、经过严格检验的产品,尽量避免使用自家苗等,从源头控制BVDV感染的可能性。