上海地区草地贪夜蛾种群的分子鉴定

黄兰兰,蒋杰贤,王金彦,张 浩*

(1上海市农业科学院生态环境保护研究所,上海 201403;2上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306)

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)属鳞翅目Lepidoptera,夜蛾科Noctuidae,灰翅夜蛾属Spodoptera,是世界十大植物害虫之一,被联合国粮农组织列为全球预警的迁飞性重大农业害虫,对全世界的农业生产造成了极其严重的影响[1-4],包括使玉米和水稻等粮食作物以及禾本科、豆科等作物减产[5-8]。草地贪夜蛾取食范围广、迁飞能力强[9-11],已从最初的原产地美洲扩散至全球100多个国家,于2019年初首次入侵我国云南地区[12-14],同年5月,上海市农业科学院害虫生态防控团队在上海市奉贤区的玉米地中首次发现了入侵的草地贪夜蛾。

对物种进行准确鉴定和监测是开展防控工作的首要条件。部分夜蛾科害虫形态差异不大,尤其是灰翅夜蛾属Spodoptera的几种夜蛾,成虫之间形态差异很小[15],而且同一物种不同亚种的昆虫形态差异可能更小,通过传统的形态学方法鉴定夜蛾种类以及亚种往往很困难。基于上述原因,用分子生物学方法鉴定和分析夜蛾科害虫具有重要意义[16]。基于线粒体细胞色素C氧化酶第I亚基(Cytochrome coxidase subunit I,COI)基因的序列分析是当前物种鉴定中最常用和最有效的分子鉴定方法。除此之外,位于Z染色体上的磷酸甘油醛异构酶(Triose-phosphate isomerase,Tpi)基因也是常用的物种标记基因[17-19],将这两种标记基因结合使用,可使鉴定结果更加可靠。为科学鉴定上海地区草地贪夜蛾亚型类型,本研究在上海郊区采集了48个夜蛾样本,利用两个物种标记基因(线粒体COI基因和核基因组Tpi基因)对其进行分子鉴定和遗传分析,以期为上海地区草地贪夜蛾的监测监控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用的害虫样本采集于上海市奉贤区(24个样本)和崇明区(24个样本)的玉米植株上。样本采集时间是2019年5月至2020年8月,田间采集后将死虫浸泡于无水乙醇中;活虫置于饲养盒中,喂食新鲜玉米叶或人工饲料[20-21]。样本带回实验室后,置于液氮中冷冻,并保存在-80℃超低温冰箱中,用于后续研究。

1.2 DNA提取和PCR扩增

用液氮将单头幼虫或成虫研磨成粉末状,利用生工试剂盒提取各样本夜蛾的DNA,纯化的DNA经1.2%琼脂糖电泳检测,并使用752型紫外可见分光光度计测定浓度,置于-20℃保存待用。分别用扩增COI和Tpi基因的引物[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]对害虫样本基因组进行PCR扩增,引物序列见表1。采用北京全式金生物技术有限公司的EasyTaq酶进行PCR扩增,PCR反应体系(20 μL):2×EasyTaq Mix 10 μL,正反向引物各0.5 μL(10 μmol∕L),ddH2O 8 μL,模板DNA(20 ng∕μL)1 μL。PCR反应程序:94℃预变性5 min,35个循环(94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min 30 s),72℃处理10 min。PCR产物使用1.5%琼脂糖电泳检测,并将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表1 PCR扩增的引物信息Table 1 Primers used for PCR amplification

1.3 数据分析

在GenBank中查找已有的草地贪夜蛾COI和Tpi基因序列,以及Spodoptera属近缘种的COI基因序列:Spodoptera frugiperda(HM136601,HM136600,HM136586),Spodoptera eridania(HM756083),Spodoptera dolichos(HM756086),Spodoptera pulchella(HM756076),Spodoptera litura(KF022223),Spodoptera littoralis(HM756074),Spodoptera exempta(HQ177331),Spodoptera triturata(KJ634312),Spodoptera exigua(HM756077)。用ClustalX软件分析获得序列的差异位点,根据已经报道的基于COI和Tpi基因的“玉米型”和“水稻型”序列特点[12,22],通过序列比对分析鉴定采集害虫样本的物种和亚型。同时利用MEGA 7.0软件分析不同物种间COI的演化关系,构建COI的系统进化树[23]。

2 结果与分析

2.1 草地贪夜蛾的形态观察

通过莱卡显微镜(型号DM 4000 B)观察不同发育时期草地贪夜蛾的形态,发现草地贪夜蛾的卵块表面一般会有覆盖着的白色鳞毛,刚孵化的幼虫全身呈现淡绿色,两个龄期之后幼虫头部会出现倒“Y”形状的纹路,而且腹部末端有4个呈正方形排列的黑点。草地贪夜蛾的蛹一般为椭圆状且呈现金黄色或者暗红色等,长度在16 mm左右。羽化之后的草地贪夜蛾成虫前部翅膀为浅棕色,后部翅膀为白色,边缘存在浅褐色带,且雌蛾与雄蛾的翅膀花纹差异明显[24],展翅长度约为35—40 mm(图1)。

图1 采自上海地区玉米田中不同发育时期的草地贪夜蛾及其寄主Fig.1 Different developmental stages of Spodoptera frugiperda collected from maize fields in Shanghai and its hosts

2.2 COI基因与Tpi基因的扩增

用COI基因与Tpi基因引物对48个样本进行PCR扩增。结果显示,这两对引物在所有样本中均扩增出了单一明亮的目的条带。COI基因扩增的DNA片段约为800 bp,Tpi基因扩增的DNA片段约为400 bp,符合预期(图2)。测序结果表明,48个样本的COI基因扩增的DNA片段均为811 bp,其中47个样本的序列完全一致(标记为COI-SH-1),另外1个样本与这47个样本存在一个碱基的差异(标记为COI-SH-2)。48个样本的Tpi基因扩增的DNA片段均为406 bp(Tpi-SH)。

图2 部分样本PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测Fig.2 Gel electrophoresis of partial samples’PCR products

2.3 COI基因的进化分析

根据测序所得的上海害虫样本的COI基因序列及GenBank数据库中的11条Spodoptera属近缘物种COI序列,以小菜蛾Plutella xylostella(Linnaeus)COI基因序列作为外群,采用Neighbor-Joining(NJ)法构建系统发育树(图3)。结果发现,上海地区样本与已知的草地贪夜蛾聚为一支,与其他物种遗传距离相对较远,表明采自上海地区的害虫样本均为草地贪夜蛾。且从系统进化树可以看出,草地贪夜蛾与亚热带粘虫Spodoptera eridania有较近的亲缘关系。

图3 临位相连法(NJ)构建COI基因序列系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree analysis constructed by the Neighbor-Joining(NJ)method based on COI gene fragments

2.4 草地贪夜蛾亚型的鉴定

将测序得到的COI基因序列与草地贪夜蛾“水稻型”和“玉米型”COI基因序列[22]进行比对,发现样本COI-SH-1与“水稻型”COI基因序列一致,样本COI-SH-2与“水稻型”COI基因有1个碱基的差异;样本COI-SH-1、COI-SH-2与“玉米型”COI基因分别有17个和16个碱基的差异(图4)。表明上海地区草地贪夜蛾种群属于“水稻型”。

图4 基于COI基因片段鉴定草地贪夜蛾的亚型Fig.4 Identification of subtypes of S.frugiperda based on COI gene fragment

将测序得到的Tpi-SH序列与草地贪夜蛾“水稻型”和“玉米型”Tpi基因[12]序列进行比对,发现样本Tpi-SH与“玉米型”Tpi基因序列一致,与“水稻型”Tpi基因序列存在9个碱基的差异(图5),表明上海地区草地贪夜蛾种群属于“玉米型”。

图5 基于Tpi基因片段鉴定草地贪夜蛾的亚型Fig.5 Identification of subtypes of S.frugiperda based on Tpi gene fragment

3 结论与讨论

利用草地贪夜蛾的标记基因COI和Tpi可以快速对样本进行分子鉴定,确定其物种及其亚型,这对于区分草地贪夜蛾与其他夜蛾,以及鉴定少量样本或组织是否来源于草地贪夜蛾具有重要作用[25]。但是,草地贪夜蛾在迁飞扩散的过程中,两个亚型种群之间可能会产生较为复杂的杂合个体,仅依靠一种或两种标记基因进行鉴定时,可能会存在误差[26],因此,结合核糖体DNA(rDNA)、随机扩增多态DNA(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)、微卫星(Microsatellite)等分子标记手段[27-29],能更准确鉴定上海地区草地贪夜蛾亚型类别。

在长期的进化过程中,草地贪夜蛾分化出了“玉米型”和“水稻型”两种亚型。两种亚型的草地贪夜蛾在寄主寻找、取食偏好等方面已经分化出了较大差异。“玉米型”草地贪夜蛾取食玉米、高粱等作物,而“水稻型”则嗜好水稻[30]。目前,我国所报道的草地贪夜蛾COI基因大部分为“水稻型”,Tpi基因大部分为“玉米型”,也有部分杂合型Tpi基因[31],本研究COI基因鉴定结果显示,采集于玉米植株上的草地贪夜蛾属于“水稻型”,而Tpi基因鉴定结果则为“玉米型”,这与我国之前对草地贪夜蛾分型的研究结果一致[26]。COI基因和Tpi基因对草地贪夜蛾亚型鉴定结果不一致的原因,一方面可能是COI基因与Tpi基因在细胞中的位置不同;另一方面,也存在COI基因和Tpi基因的部分位点已经杂合的可能性。结合作者团队近2年未在上海地区的水稻上监测到草地贪夜蛾这一情况,认为上海地区的草地贪夜蛾更倾向于“玉米型”。但由于取样地点、时间和取样数目的局限性,并不能完全排除“水稻型”草地贪夜蛾已经侵入上海地区,且目前已经在我国部分地区发现了“水稻型”草地贪夜蛾[22,32]。另外,上海处于亚热带地区,水稻种植面积大于玉米种植面积,因此更需要密切关注不同分型的草地贪夜蛾在上海地区的发生和为害特点,加强对其他潜在寄主作物上草地贪夜蛾为害的监控,做好草地贪夜蛾的监测和防控工作。