红皮莲子中黄酮的提取研究

2022-11-02钟云红黄盈盈

四川化工 2022年5期

钟云红黄盈盈

(四川工商职业技术学院，四川都江堰，611830)

红皮莲子，外观呈卵形或类球形，属睡莲科，是水生植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)在秋季采摘成熟的莲蓬[1]，剥取果实，撕去果皮，干燥后的种子，养脾止泻、止带，具益肾涩精和静心安神之功效[1-4]。大家将植物莲成熟种子中的胚根和绿色嫩叶称为莲心[1]，又称莲子心、苦薏、莲薏，长1-1.4 cm，通常呈细圆筒形[1-4]。莲子心没有明显的气味，尝起来有苦味，其药用历史悠久，是一味重要的中草药，具有药理和食用研究价值[2]。莲子性味甘、平、微涩，其化学成分十分复杂，不仅含有丰富的黄酮类化合物和生物碱类，还含有挥发性油类、多糖等其他活性成分[2-4]。黄酮类化合物具有C6-C3-C6的基本骨架，含有2-苯基色原酮的结构[5]，在植物界分布非常普遍，同时也是莲子心除生物碱以外的主要化学成分[6-7]。遗憾的是黄酮类化合物不能在人体内自己合成，必须从食物和药物中摄取[5]。目前已应用于药品和保健产品，它们对人类健康起着十分重要的作用。黄酮类物质曾被叫作“维生素P”，能有效祛除体内自由基，具有抗氧化、抗肿瘤和抗辐射等功效[6-9]。纯天然黄酮类化合物绝大部分与糖结合形成碳糖基或苷类，黄酮固体普遍为无定形粉末，其余黄酮类化合物多为结晶固体[5-6]。而莲子的黄酮含量丰富，其中莲子外壳和莲子心中均含有一定量的黄酮。

目前，黄酮类化合物的提取，实验室常采用热水提取法、碱提取法[9]、有机溶剂提取法、酶辅助提取法、微波辅助提取法[10]、超声波辅助提取法[2,4,11]及超临界流体提取法等方法[9]。但海文[12]等人使用碱提酸沉法提取黄酮，优选出了最佳的提取方法；宋晓凡[13]等人对空心莲子草中黄酮的提取进行了进一步研究。文献资料中探究较多的是莲子心中黄酮的提取，红皮莲子中黄酮的提取报道尚未查阅到。本课题选取福建建宁县红皮莲子为实验原料，探索红皮莲子中总黄酮的提取，研究红皮莲子中黄酮的最佳提取条件及影响因素，为红皮莲子中黄酮功能因子的进一步开发利用提供参考依据[8]。

1 材料与方法

1.1 实验原料、试剂及仪器

1.1.1 实验原料

红皮莲子，取自福建建宁县，市售，属初级农产品。

1.1.2 实验试剂

芦丁标准品(HPLC≥98%，合肥博美生物科技有限公司)；氢氧化钠(AR)、无水乙醇(AR)、亚硝酸钠(AR)、硝酸铝(AR)，均购自成都金山化学试剂有限公司；蒸馏水(自制)。

1.1.3 实验仪器

电子天平(TB-215D，d=0.01 mg，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；高速万能粉碎机(FW100，天津市泰斯特仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9240A，上海三发科学仪器有限公司)；恒温培养振荡器(ZHWY-100C，上海齐欣科学仪器有限公司)；800电动离心机(常州市国旺仪器制造有限公司)；紫外-可见分光光度计(UV-1800，上海翱艺仪器有限公司)。

2 实验原理

黄酮类化合物大多具有酚羟基，故呈弱酸性，其酸性大小与酚羟基所在的位置和数量有关，基于不易溶于酸水而易溶于碱水的化学属性，选取碱溶酸沉淀法，即使用碱水提取液加酸酸化，析出黄酮类化合物[6]。在弱碱性或中性条件下，滴加亚硝酸钠溶液，铝盐与黄酮类化合物反应形成螯合物，滴加氢氧化钠溶液时出现橙红色。通过黄酮类化合物与金属离子发生络合反应，显色后，在最佳吸收波长条件下测定吸光度。根据标准曲线方程求出总黄酮浓度，再按照以下的公式计算红皮莲子中总黄酮的提取率。

红皮莲子总黄酮的提取率(%)：

式中：Y——红皮莲子总黄酮的提取率(%)；c——根据绘制的标准曲线求出的总黄酮溶液的浓度(mg/mL)；n——测定时提取液的稀释倍数；V——提取时待测溶液的体积(mL)[9]；m——红皮莲子粉的质量(g)[10-11]。

2.1 样品制备

将采购的红皮莲子倒入洁净干燥的白瓷盘中，在75 ℃的电热恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重，用万能粉碎机磨碎成粉末，通过40目筛，然后转移至棕色磨口试剂瓶中，备注上标签，保存在干燥器中备用[2]。

2.2 最大吸收波长的确定

将芦丁标准溶液和待测样品进行显色反应后，以第一支比色管作为试剂空白调零，在200—600 nm波长范围内扫描，每隔10 nm进行波长的测量，测量结果表明，芦丁标准溶液与待测样品均在510 nm处吸光度值最大。因此，实验中确定的最大吸收波长为510 nm，与查阅的相关文献一致。

3 实验探究

3.1 标准曲线的绘制

将浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分别准确转移到10 mL已编号的比色管中[14]，依次补充50%乙醇溶液到5 mL的刻度线；再逐一加入0.3 mL的5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min；再加入0.3 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min；然后加入4 mL 1 moL/L氢氧化钠溶液，振荡混匀，最后再用蒸馏水定容至10 mL的刻度线[2,14-15]，混合摇匀，静置15 min；以第一支比色管(试剂空白)为参比溶液调零，设置波长为510 nm，依次测定其吸光度，根据浓度和吸光度值，完成标准曲线的绘制[2]。

图1 标准曲线的绘制

3.2 最佳提取剂浓度的选择

黄酮类物质通常容易溶解于强极性溶剂水、甲醇、乙醇等，难溶于有机溶剂三氯甲烷、苯等，因此实验中多选取甲醇和乙醇作为提取黄酮类化合物的溶剂[2,16-17]。常利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同的特征，选取不同浓度的溶剂进行提取，以期达到分离纯化的效果。考虑到甲醇毒性大，乙醇安全无毒、操作容易、回收利用方便等因素，选取乙醇作为提取剂[2]。本次实验主要探索乙醇浓度对提取效果的影响，探索出最佳的乙醇浓度。

准确称取20.00 g红皮莲子粉于一系列已编号的具塞锥形瓶中，依次加入70 mL浓度为30%、40%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，盖上瓶塞，在55 ℃恒温培养振荡器中，振速150 rpm连续提取30 min后，取出上层清夜或过滤后，离心25 min，测定吸光度，计算黄酮类物质的提取率。绘制乙醇浓度与提取率的关系图，见图2。

图2 提取剂乙醇浓度对黄酮提取率的影响

由图2可知，随着乙醇浓度的增加，红皮莲子中黄酮的提取率也逐渐提高[2]；当乙醇浓度为30%—70%时，黄酮提取率提高显著；当乙醇浓度升到70%后，黄酮提取率提高比较缓慢。根据溶质比例确定其溶剂的量，当乙醇浓度过低需要延长有效的实验提取时间，导致实验时间拖长，并且并不能完全将红皮莲子中的黄酮浸提出；当乙醇浓度过于饱和时不利于黄酮的提取，乙醇的用量也比较浪费。因此，在提取过程中提取率最佳的同时也必须保证实验的效率。综合以上因素，选择的乙醇浓度以70%为最佳，此时的提取率也极佳。该方法具有应用广泛、安全、经济、易操作和方便等优点。

3.3 最佳料液比的选择

准确称取20.00 g红皮莲子粉放入若干具塞锥形瓶中，按1:2、1:3、1:4、1:5、1:6的料液比加入相应的70%乙醇，盖上瓶塞，置于55 ℃恒温培养振荡器中，振速150 rpm进行浸提30 min，选择最佳料液比[17]。

从图3可知，提取料液比的多少直接影响着黄酮的提取率。当料液比为1:2、1:3时，红皮莲子中黄酮不能充分浸取出，其浸出率比较低；当料液比为1:4时，黄酮的提取率最高，达到3.1%；当料液比为1:5时，黄酮提取率曲线呈急剧下降趋势，这一现象的原因可能是红皮莲子提取过程中有除黄酮以外的杂质析出，导致其浸出率降低。因此，选取最佳料液比为1:4。

图3 不同料液比对黄酮提取率的影响

3.4 选择最佳提取时间

提取时间也是影响莲子中黄酮提取率的重要因素之一。准确称取20.00 g红皮莲子粉放入若干具塞锥形瓶中，加入80 mL 70%乙醇溶液，盖上瓶塞，放入55 ℃恒温振荡器中，选取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min作为提取时间，取出上层清夜或者过滤后，离心测定吸光度，计算其提取率。

根据图4可知，黄酮提取率随着时间的增加而增大，溶液的颜色也随着时间的延长而逐渐变深，达到40 min时，提取效果最好，提取率为3.6%。再延长时间到50 min，甚至反应更长时间，提取率反而降低，主要是时间延长会导致红皮莲子中其他杂质的析出，降低提取率，但提取时间短则红皮莲子中的黄酮类物质不能充分提取出来[14]。因此，红皮莲子中黄酮的最佳提取时间设为40 min，此时的浸出率也是最佳的。

图4 时间对黄酮提取率的影响

3.5 最佳温度的选择

由于分子在温度较高时易于扩散和运动，温度对其浸出率也有一定的影响。准确称取20.00 g红皮莲子粉放入若干具塞锥形瓶中，加入80 mL 70%乙醇溶液，盖上瓶塞，在不同温度的恒温振荡器中连续提取40 min后，取出上层清夜或者过滤后，离心测定吸光度，计算黄酮类物质的提取率。本次实验探究了在其他条件一致的情况下，不同温度对红皮莲子中黄酮提取率的影响。

由图5可知，在20—80 ℃时，红皮莲子黄酮的提取率随着温度的增高而增大，上升到70 ℃时黄酮的提取率为4.0%，80 ℃时黄酮提取率逐渐降低。在相对较低的温度下提取的杂质较少，红皮莲子中的黄酮成分未被完全浸提出；随着温度的增高，黄酮类成分溶解、扩散、渗透的速度加快，其提取率也增加；但温度不能过高，温度过高，极易破坏黄酮类成分，同时杂质的含量也逐渐增加[14,18]。由于红皮莲子的提取溶液稳定性较差，主要表现为褐变速率快，极易出现沉淀物。因此，当达到适当的温度时，黄酮类化合物能够被充分提取出来。综合考虑，最佳提取温度为70 ℃。