聚合物表面细胞外基质基复合涂层的构建及其细胞响应

童汇慧,孙 媛

(1.浙江工商大学,浙江 杭州 310018;2.浙江大学 材料科学与工程学院,浙江 杭州 310027)

1 前 言

聚四氟乙烯(PTFE)等不可降解聚合物材料在生物医用领域得到了广泛的研究,其良好的生物稳定性和极低的机体排斥作用[1-2],使得其在永久性的植入体方面具有独特的优势。在隆鼻假体等领域已取得较多的使用[3-4]。然而,这些材料通常表面能较低、表面疏水性强,这使得细胞在其表面附着及后续的组织再生等过程有着不利的作用,并直接影响其在生物体内长期的性能[5]。

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)由细胞分泌,具有三维网络,主要由胶原、层粘连蛋白以及糖胺聚糖等构成,为细胞提供可供结合的位点,并调控其黏附、迁移、增殖、分化等[6-8]。已有大量研究将ECM主要成分,如胶原蛋白[9-10]、层粘连蛋白[1-12]或纤连蛋白[13]等用于材料表面修饰,以改进材料表面与细胞的相互作用。因此,ECM 本身具有作为生物材料应用的潜力。ECM 可由组织或器官脱细胞获取并用于组织工程等[14]。近年来通过体外细胞培养获取ECM 得到广泛的研究,所获ECM 能有效模拟细胞微环境的组成和结构[15]。而且,与通过组织获取的ECM 相比,体外细胞培养获取的ECM 在可复合性、仿生结构以及来源等方面都有其独特的优势。Datta等[16]研究发现具有ECM 涂层的钛网表现出优于纯钛网的碱性磷酸酶活力和钙磷酸盐矿化沉积;Liao等[17]在聚己内酯微纤维支架材料上接种间充质干细胞,获得含ECM 的复合支架,同样表现出增强的碱性磷酸酶活性和钙磷酸盐沉积,且其增强程度与ECM 含量相关,ECM 含量越高,成骨诱导能力越强。细胞获取ECM 在体内成骨研究也显示出增强间充质干细胞成骨能力[18]、增强植入材料表面矿化[19]的能力。Wang等[20-21]通过高密度、长时间培养软骨细胞获得细胞膜片,该细胞薄层既具有细胞的特点,也具有组织的结构特性。脱细胞后得到的ECM 移植到兔膝关节骨软骨缺损处后,6周和12周均显示出良好的修复效果,有大量新生软骨组织产生。

然而,当ECM 用于一些聚合物材料表面修饰时,在表面上直接制备ECM 表层较为困难,这往往是由于与聚合物亲水性差、表面能较低等特性有关。近年来聚多巴胺(PDA)的发展提供了一种新的可能解决方案。PDA 具有生物相容性好[22]、可自聚成膜且几乎可以黏附在绝大多数材料表面[23-24]等特点,因此可将PDA 作为结合剂实现多种材料表面涂层或薄膜的制备。Wang等[25]利用这一特点将体外培养获得的细胞片层直接作为金属植入体表面涂层,发现其具有良好的诱导干细胞成骨分化的特性。

本研究将体外培养而来的ECM 通过PDA 化学及原位共沉积法在PTFE 表面获得了ECM 基涂层,并对其特性和细胞响应性等进行了评估。

2 实 验

2.1 涂层制备

将小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)以5×104cells/cm2的密度接种于细胞培养专用的无菌24孔板内,2 d更换一次培养基,培养7 d,细胞分泌细胞外基质形成细胞片层。移去培养基,用超纯水反复清洗,清洗过程中片层自动脱落。最后通过反复冻融的方法去细胞:将置于超纯水中的细胞片层放入-80℃快速冷冻30 min,然后取出室温解冻,解冻后再放入-80℃冷冻30min,如此循环三次以上。最终获得的ECM 涂层置于超纯水中-20℃保存备用。

在Tris-HCl 缓冲溶液中(p H=8.5)配制2 g/L的盐酸多巴胺溶液,将PTFE 基板浸泡于此溶液中12 h,制备得到PDA 沉积修饰的PTFE 基板。PDA修饰的基板用去离子水清洗5 次后,将之前获得的ECM 涂层转移至该基板上并置于37℃的恒温箱内12 h,使ECM 与PDA 之间充分化学连接与干燥,构建得到PDA-ECM 复合涂层。

2.2 涂层表征

所得的ECM 复合涂层的表面形貌通过扫描电子显微镜(SEM)观察,其组成化学元素通过能谱分析仪(EDS)分析;涂层的表面粗糙度通过原子力显微镜(AFM)确定;通过接触角测量仪(OCA20)表征基板表面的润湿特性。利用涂层与基板结合的剪切强度评价两者的结合牢固程度:将强力胶带粘结于涂层表面,记录水平方向拉扯胶带时应力变化进而计算剪切强度[26]。细胞片层中的残余细胞以及胶原蛋白(Col-I)和层粘层蛋白分布等采用DAPI染色和免疫组化荧光染色表征。

2.3 生物学评价

采用鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)在ECM 涂层表面的黏附与增殖评价涂层的生物相容性。将BMSC细胞置于37℃,5%CO2体积分数的具有饱和湿度的细胞培养箱内培养,分别于1 d、3d和5 d通过CCK-8试剂盒表征细胞粘附和增殖状态[26]。细胞的黏附与铺展情况通过钙黄绿素染色后在荧光显微镜观察评价。同时,通过对ALP水平的表征评价不同表面培养的BMSC的成骨分化情况。

2.4 统计学分析

生物学数据评价采用SPSS软 件中的单因子方差分析方法(one-way ANOVA)和Scheffe’s post hoc方法,对两个组(样本数n≥3)的所有平行数据进行比较分析,当P＜0.05时,数据具有显著性差异。

3 结果与讨论

如图1所示,首先对获得的细胞片层进行主要成分Col-I和LN 的免疫组化荧光染色。同时,染色用细胞片层未采取脱细胞处理,并对细胞核进行DAPI染色,方便观察基质蛋白与细胞的分布情况。染色结果表明,实验获得的细胞外基质存在有大量的Col-I和LN,且紧密分布于细胞周围。

图1 细胞片层的荧光显微照片Fig.1 Fluorescent microscopic micrographs of the cell sheets (a)DAPI; (b)Col-I; (c)LN

如图2扫描电镜图所示,由于PDA 在潮湿状态下具有很强的黏附性能,其可以在大部分材料表面形成涂层。PTFE基板表面不平整,存在条形或块状起伏。通过浸泡沉积后,底部因沉积一层PDA 变得致密,起伏沟壑减少,同时表面还有颗粒状PDA 堆积。表面固定ECM 后能明显观察到基板表面被具有一定厚度的ECM 所覆盖,展示的形貌即为ECM平整致密的形貌,表面因干燥过程出现了一些孔隙。表面的成份变化如表1所示,PTFE基板中主要含有F、C两种元素,PDA 浸泡处理后O 元素含量的增加验证了PTFE 基板表面沉积了一层PDA。固定ECM 后原基板元素F所占原子比大幅降低,C、O 元素因为大量存在于ECM,所以含量随ECM 的固定而增加。

图2 不同表面的形貌照片 a.PTFE;b.PTFE-PDA;c.PTFE-PDA-ECMFig.2 Surface Morphology of the samples a.PTFE;b.PTFE-PDA;c.PTFE-PDA-ECM

表1 表面成分及接触角Table 1 Surface composition and contact angles

PDA-ECM 作为复合涂层对植入体表面进行修饰,其与基板的结合力也是关键问题,如果结合力弱,涂层处于体液环境下脱落,就无法达到真正的表面改性。因此,采用万能拉伸实验法对PDA-ECM 复合涂层与基板之间的结合牢固程度进行检测,如图3所示。实验结果表明,复合涂层与PTFE 基板的剪切强度达到14.4 MPa,这显示涂层能够较为牢固地结合于PTFE表面。

图3 PDA-ECM 涂层与PTFE的结合力Fig.3 Adhesion strength of PDA-ECM coatings on PTFE

亲疏水特性影响细胞在其表面的黏附,并对后续发生的细胞迁移、增殖和分化具有重要影响。PTFE基板均为疏水基板,将极大地阻碍细胞粘附增殖。如表1所示,由于PDA 具有良好的亲水性,PDA浸泡沉积后的基板亲水性均得到了提高,由102°降为42°左右,这也再次证明了PDA 膜的有效沉积。细胞外基质表面暴露有各种亲疏水基团,固定后影响涂层的亲疏水性。固定ECM 后的材料表面亲水性进一步提高,这在一定程度上利于后续细胞在基板上的粘附增殖。后期细胞培养时ECM 与细胞充分接触,保证细胞生长良好。

分别将BMSCs接种到PTFE、具有PDA 的基板和具有PDA-ECM 复合涂层的基板上,培养24 h 后进行钙黄绿素染色,染色结果如图4所示。从图可见,PTFE因强疏水性和化学惰性,细胞难以附着于材料表面,黏附数量很少;PDA修饰后基板生物相容性提高,表现为细胞数量的增加和细胞铺展的改善;PDA-ECM 固定后细胞铺展状态更为显著改善,且细胞形态较多呈现为梭形。通过两组基板的对照实验可以确认,PDA 和PDAECM 赋予了基板更优异的生物相容性,尤其是ECM 因其丰富的成分和识别位点有利于细胞铺展。

图4 不同表面的BMSCs细胞形态Fig.4 BMSCs cells morphology on the surfaces (a)PTFE; (b)PTFE-PDA; (c)PTFE-PDA-ECM

图5为采用CCK-8 法定量检测BMSCs在的黏附增殖的结果。依次在细胞接种后的第1、3、5 d进行测定。1 d数据可视作BMSCs的黏附情况,表面改性后基板的细胞黏附数量增加,与钙黄绿素结果一致。3、5 d数据视作细胞增殖情况,PDA-ECM 涂层增殖明显优于PDA,PDA 组在后期增殖速率减慢,证明ECM 在促进细胞的黏附增殖上发挥了更长期、更关键的作用,可以显著改善细胞材料表面的行为。

图5 不同表面的BMSCs细胞增殖Fig.5 BMSCs proliferation on the surfaces

碱性磷酸酶(ALP)是成骨分化的早期指标。如图6所示,ALP结果显示,PTFE表面因其具有极强的生物惰性而不利于细胞生长,OD 数据也能观察到增殖速率几乎为零,其ALP 数据显示为负数,不具备分析意义。而经过PDA 或PDA-ECM 修饰后,ALP 活力相较于纯基板得到了提高,而且PDA 组与PDA-ECM组的ALP活力无明显差异。但是,这一指标只能反应所附着的细胞的活性,无法反应所附着细胞量的多少。进一步结合图5的细胞黏附数据综合考量,可以发现PDA-ECM 涂层能促进细胞附着、铺展良好并增殖的同时,又能起到良好的促成骨分化作用,具有较好的综合性能。

图6 不同表面培养BMSCs细胞的ALP水平Fig.6 ALP Activities of BMSCs cells on the surfaces

4 结 论

通过体外细胞培养、循环冷冻脱细胞处理以及PDA 原位共沉积,能够有效地在PTFE基板表面构建出PDA-ECM 基复合涂层,涂层与PTFE 基板的剥离剪切力达到14.4 MPa,显示出其能牢固地结合于PTFE表面。复合涂层的表面细胞相容性得到了显著提升,间充质干细胞在其表面的附着及增殖情况均优于未改性的PTFE基板。细胞形态良好,并显示出更高的碱性磷酸酶水平。鉴于PDA 与聚合物反应的普适性很强,这种方法可以有效地在不同种类聚合物基板表面沉积ECM 基复合涂层,进而显著提高其表面的细胞响应性,提升表面与组织细胞相互作用的性能。