ACTN4通过靶向NDUFV1对食管鳞状细胞癌的细胞增殖的影响

冯 成，程晓敏，谢一清，康利平，孙璋然，范 旭，耿慧武，刘晓颖

食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是我国常见的消化道恶性肿瘤，发病率和病死率居高不下，急需有效的诊断和治疗手段。α-辅肌动蛋白(alpha-actinins, ACTNs)定位于细胞-细胞和细胞-细胞外基质的接触部位，通过将膜受体与细胞骨架相连来调节不同信号通路的转导途径[1]。α-辅肌动蛋白家族有四个成员，α-辅肌动蛋白-4(alpha-actinin-4, ACTN4)作为成员之一，在细胞中的分布广泛，并能够参与多种细胞生命活动，如细胞增殖、细胞运动及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)等[2-3]。同时，在细 胞信号转导过程中ACTN4也发挥着重要作用，如参与核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、Wnt / β-catenin等多种信号通路的调控[4-5]。在肝癌细胞中，ACTN4能够调控AKT/mTOR通路促进癌症的进展[6]。ACTN4已经被证实可以通过影响NF-κB的活性促进肿瘤细胞的迁移能力。该研究在ESCC中探究ACTN4的表达情况及其对细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1试剂与抗体 RPMI-1640培养基、DMEM(高糖)培养基和Opti-MEM购于美国GE公司；胎牛血清购于美国CLARK Bioscience公司；胰酶消化液购于德国Bio-Froxx公司；Lipofectamine RNAiMAX和Lipofectamine 2000试剂购于美国Thermo-Fisher公司；一抗稀释液、青链霉素溶液、Western及IP细胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)购自上海碧云天生物技术有限公司；DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司；二甲亚砜(DMSO)购于德国Sigma-Aldrich公司；ACTN4、NADH ∶泛素氧化还原酶核心亚基V1(NADH ∶ubiquinone oxidoreductase core subunit V1, NDUFV1)和β-actin抗体购于武汉Proteintech公司。

1.1.2主要仪器 BSC-2级生物安全柜(1300 SERIES A2)、二氧化碳恒温培养箱(VIOS160i)(美国Thermo Fisher公司)；倒置光学显微镜(TS-100，日本尼康公司)；倒置荧光显微镜(Dmil LED，德国Leica公司)；高速冷冻离心机(Allegra 30r，美国Beckman Coulter公司)；恒压电泳仪(PowerPac Basic，美国BIO-RAD公司)。

1.1.3shRNA ACTN4 shRNA质粒由本实验室保存，序列见表1。

表1 针对ACTN4的shRNA序列

1.1.4组织和细胞 91例食管鳞状细胞癌组织于2016—2017年分批取自安徽医科大学第一附属医院普胸外科，经胸腹腔镜根治术切除的食管组织，在确保病理检测的前提下切取小部分组织分别保存于-80 ℃及福尔马林固定、包埋。所有患者于术前已阅读并签署“组织取材知情同意书”，并上报所在医院医学伦理部备案。食管鳞状细胞癌细胞ECA109和人胚胎肾细胞HEK 293T细胞为本实验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1免疫组化实验 选取91例ESCC的组织芯片梯度复温；将组织芯片置于45 ℃二甲苯溶液中脱蜡25 min，重复1次；将组织芯片依次放入100%乙醇10 min，100%乙醇3 min，95%乙醇3 min，85%乙醇3 min，75%乙醇3 min，双蒸水1中3 min，双蒸水2中3 min，梯度脱蜡至水；3% H2O2去除内源过氧化氢酶30 min，PBS清洗3次；1%脱脂牛奶封闭30 min；4 ℃孵育一抗过夜，次日PBS清洗3次；室温孵育二抗30 min，PBS清洗3次；DAB溶液显色(时间根据情况而定)，双蒸水终止反应；苏木精溶液染核1 min，双蒸水清洗，烘干后封片，镜下观察并委托武汉塞维尔生物技术有限公司进行扫描。

1.2.2免疫组化实验结果打分细则 对TMA芯片扫描结果进行打分，根据组织的染色强度和染色数目不同，将染色强度分为弱染色、中等染色和强染色三个等级，分别计为1～3分；将染色数目分为0～25%，26%～50%，51%～75%，76%～100%四个等级，分别计为1～4分。将二者相乘可得ACTN4在组织中的相对表达量得分。

1.2.3细胞培养 ECA109细胞使用含8%胎牛血清的RPMI-1640培养基，HEK 293T细胞使用含8%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基，置于37 ℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中分别培养；培养的细胞每2 d更换培养基，细胞汇合度大于90%时进行传代，使用胰酶消化液对细胞进行消化，用培养基终止消化反应并计数。

1.2.4shRNA敲低实验 将HEK 293T细胞以1×106个/孔的数量接种到6孔板。次日观察细胞状态及汇合度合适即可进行慢病毒包装，将 shACTN4-1/shACTN4-2/ pLKO.1(空载)、Rev、GAG和VSVG按2 ∶2 ∶2 ∶1的比例用Opti-MEM混合；再以1 ∶1的比例稀释Lipofectamine 2000试剂，将二者混合静置15 min；弃去6孔板中的培养基，加入上述混合液继续培养24 h；将ECA109细胞以2×105个/孔的数量接种到6孔板。第3日观察ECA109细胞状态及汇合度；HEK 293T细胞培养到24 h时，收取培养基离心保留上清液；弃尽ECA109细胞6孔板中的培养基，加入上述上清液并标记为4组：①未处理组(正常培养基)；②pLKO.1组(阴性对照，pLKO.1慢病毒颗粒感染)；③shACTN4-1组(shACTN4-1慢病毒颗粒感染)；④shACTN4-2组(shACTN4-2慢病毒颗粒感染)。继续培养6 h后更换新鲜培养基；继续培养48 h后，可通过荧光显微镜观察慢病毒感染效率；若感染效率良好，则将细胞消化后转移至T25细胞培养瓶中，并用嘌呤霉素(4 μg/ml)药筛2 d，之后梯度降低嘌呤霉素浓度继续药筛，1周后检测shRNA敲低效果。

1.2.5Western blot实验 加入适量Western及IP细胞裂解液(含1% PMSF)裂解细胞，冰上静置30～40 min；4 ℃、14 000 r/min离心20 min；转移上清液，Bradfrod法测定蛋白浓度；样品加入上样缓冲液沸水浴5～10 min，每个样品取30 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，转移蛋白至PVDF膜；5%脱脂牛奶封闭1.5 h，TBST清洗3次，每次10 min；孵育一抗4 ℃过夜，次日TBST清洗3次；再室温孵育二抗1.5 h，TBST清洗3次；显影。

1.2.6细胞克隆形成实验 按照步骤1.2.4中进行操作，转染后48 h胰酶消化细胞后进行计数。按照1 000～2 000个/每孔将细胞接种到新的6孔板进行克隆形成实验，每3 d更换培养基，持续培养10 d后，观察单个克隆直径达到1 mm取出6孔板弃尽培养基，PBS清洗2次，预冷的70%甲醇固定10 min，结晶紫染色20 min，流动水洗去浮色，烘干后拍照记录。

1.3 统计学处理采用SPSS 16.0软件对实验数据进行统计分析。实验重复3次，所有计量资料取小数点后3位并用表示，使用t检验分析两组结果之间的差异性，P<0.05为差异有统计学意义；相关性分析采用斯皮尔曼相关(Spearman)系数法进行分析，依据两列成对等级的各对等级数之差来进行计算的，相关系数用ρ表示。

2 结果

2.1 ACTN4在ESCC组织中表达情况ESCC组织与正常食管上皮组织交替排列(n=91)(图1A)，在ESCC组织中ACTN4呈现普遍的特异性高表达，且主要在细胞质内表达；在正常食管上皮组织中ACTN4同样在细胞质中存在，但表达量较低，并且随着食管上皮继续向表层分化，ACTN4的表达量逐渐减少(图1B)。TMA芯片打分结果显示ESCC组织中ACTN4的表达量高于正常食管上皮组织，二者差异有统计学意义(图1C)。进一步通过Spearman相关系数对打分结果和病例的病理信息进行统计分析(表2)，结果显示ACTN4的表达与ESCC病例中临床病理特征均无相关性，但ACTN4在ESCC组织中的表达量高于正常食管上皮组织。据此推测ACTN4在ESCC中的表达上调是一个早期事件。

图1 IHC法检测ESCC组织中ACTN4的表达A：TMA组织芯片扫描图；B：ESCC组织和正常食管上皮组织ACTN4 DAB显色结果；C：TMA组织芯片IHC结果打分柱状图；1：ESCC组织；2：正常食管上皮组织；与正常食管上皮组织比较：****P<0.000 1

表2 TMA芯片打分和病理资料间的统计学分析

2.2 ACTN4稳定低表达ECA109细胞株的构建荧光显微镜观察慢病毒的感染效率，如图2A所示，绿色荧光占比可达约85%，表明ACTN4 shRNA慢病毒良好的感染效率。经过嘌呤霉素药筛后，细胞培养至汇合度90%～95%时收集细胞沉淀进行Western blot，结果显示shRNA敲低组相比于阴性对照组(pLKO.1)ACTN4的蛋白水平降低(图2B)。该结果表明，ACTN4稳定低表达的ECA109细胞株构建成功。

图2 ACTN4稳定低表达的ECA109细胞株的构建A：ECA109细胞感染ACTN4 shRNA慢病毒质粒48 h的感染效率图；BF：自然光；GFP：绿色荧光；B：ECA109细胞感染ACTN4 shRNA慢病毒质粒嘌呤霉素药筛后蛋白表达；1：pLKO.1组(阴性对照)；2：shACTN4-1组；3：shACTN4-2组；4：未处理组

2.3 ACTN4 shRNA敲低对ECA109的细胞增殖的影响克隆形成实验结果显示，相比于阴性对照组，ACTN4 shRNA敲低组克隆的数量和大小都有明显降低(图3)。该结果提示，敲低ACTN4抑制了ESCC细胞的增殖，即ACTN4能够促进ESCC的细胞增殖。

图3 ACTN4稳定低表达ECA109细胞克隆形成染色结果1：pLKO.1组(阴性对照)；2：shACTN4-1组；3：shACTN4-2组

2.4 ACTN4 shRNA敲低对NDUFV1蛋白表达的影响利用之前构建的ACTN4稳定低表达ECA109细胞株进行Western blot，结果显示，ACTN4敲低的ECA109细胞中NDUFV1蛋白水平降低。见图4。

图4 ACTN4 shRNA敲低下调NDUFV1蛋白表达1：pLKO.1组(阴性对照)；2：shACTN4-1组；3：shACTN4-2组

3 讨论

癌症是威胁人类健康的主要杀手，食管鳞状细胞癌作为病死率极高的癌症，深入研究其发生发展并寻找有效的诊断和治疗手段非常必要。ACTN4属于肌动蛋白结合蛋白家族，最初被认为是一种与癌细胞运动密切相关的非肌肉型α-肌动蛋白。ACTN4具有许多不同功能，如参与细胞骨架的构建、调节核转录因子的活性及病毒的复制等[7-8]。研究显示，在多种肿瘤中ACTN4表达升高：在唾液腺癌和舌癌中发现其基因拷贝数存在异常，且其基因所在的染色体19q区域发生了异常扩增[9]；在结直肠癌和肺癌中ACTN4呈现高表达且与淋巴结转移存在相关性[10]。ACTN4基因可能作为促癌因子参与某些肿瘤的侵袭、转移及细胞周期调控。研究[11]显示，ACTN4能够与远端上游元件结合蛋白1(FUBP1)相互作用调节原癌基因MYC的表达促进乳腺癌的发生发展；ACTN4已经被证实与EMT密切相关，能够调控NF-κB信号转导促进EMT的激活和发展，从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。本课题组前期研究[12]表明，在黑色素瘤中ACTN4可以参与调节受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)的稳定性并激活NF-κB从而促进黑色素瘤的细胞增殖。这些研究表明ACTN4在肿瘤发生发展和转移中的重要性。本研究结果显示ACTN4在ESCC组织中表达上调，但其表达与目前掌握的病理资料中的临床病理特征无相关性；shRNA技术和克隆形成实验结果表明，ACTN4敲低抑制ESCC细胞的克隆形成能力，即ACTN4能够促进ESCC的细胞增殖。表明在ESCC发生的早期ACTN4就发生了高表达并通过促进细胞增殖促进ESCC的发展，且一直持续到恶性阶段，提示ACTN4作为ESCC早期诊断的预测标志物的可能；ACTN4促进细胞增殖的具体机制仍待探究。值得注意的是多项研究[13-14]表明ACTN4可影响细胞周期及细胞迁移能力，从而影响其生物学行为，进一步表明ACTN4可能为潜在的肿瘤治疗靶点。

研究显示，NDUFV1能够参与线粒体呼吸链氧化磷酸化为细胞提供能量的过程，NDUFV1的缺陷是线粒体功能障碍的常见原因，且与肌病、脑肌病和神经退行性疾病(如帕金森病和利氏综合征)有关[15]；在肺癌细胞中敲除NDUFV1，细胞的存活和耐药能力显著降低[16]。本研究表明，在ESCC细胞中ACTN4敲低抑制了NDUFV1的蛋白表达。由此推测，ACTN4敲低所致的NDUFV1表达降低可能导致ESCC细胞内线粒体功能障碍，从而抑制ESCC细胞的增殖。这为进一步探究ACTN4在ESCC中的具体分子机制奠定了基础。

ACTN4参与了不同信号通路的调控，且越来越多的ACTN4相互作用蛋白被发现，丰富了ACTN4在肿瘤中的蛋白调控网络及作用机制研究，推动了以ACTN4为靶点的抗癌化合物的研发。如鞣花酸能够破坏ACTN4与β-catenin的相互作用从而抑制乳腺癌的转移[17]。基于不同肿瘤存在异质性及化疗药物存在毒副反应等问题，以及ACTN4可否作为肿瘤治疗的靶点仍需进一步探究。