真核细胞翻译起始复合物4F对HCC患者的预后价值

钱仁哲，周大臣，陆子恒，贺 良，潘树波，张 彬

原发性肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，居全球恶性肿瘤病死率的第二位，而其中以肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)最为常见[1]。目前，手术切除是HCC最有效的治疗手段，射频消融、动脉栓塞化疗、放疗及索拉非尼等靶向药物治疗也均可改善患者预后[2]，但是HCC患者的预后仍难以令人满意。因此，寻找有效的起到预后监测作用的分子标志物有着重要意义。

真核细胞翻译起始复合物4F(eukaryotic cell translation initiation complex 4F，EIF4F)调控基因包含了4EBP1、EIF4E、EIF4G等[3-4]。细胞生长过程依赖于一个复杂的大分子合成协调程序，该程序可以适应环境的约束。在真核生物中，哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路是这一过程的主要调控因子，部分通过控制EIF4F起始复合物来调节真核细胞mRNA的翻译。本课题组前期研究显示，在HCC细胞系中突变4EBP1的T37/46磷酸化位点，HCC细胞的增殖被显著抑制，并推测其可能与HCC患者的临床预后相关。该研究评估EIF4F复合物与HCC患者预后临床之间的相关性，以期预测HCC患者预后生存期。

1 材料与方法

1.1 主要材料胎牛血清购自美国Gibco公司；一抗4EBP1、Phop(T37/46)-4EBP1、EIF4E,Phop(Ser209)-EIF4E、EIF4G购自美国CST公司；山羊抗兔或抗鼠二抗购自北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1临床数据的收集与分析 从标本库中筛选出符合纳入条件的HCC患者组织，筛选时间为2000—2014年，制作组织芯片(tissue microarray,TMA)。其纳入标准为：①病理明确诊断的HCC患者；②首次行手术治疗的患者。排除标准为：①肿瘤复发患者；②术前有使用化疗及靶向药物的患者；③同时发生了其他部位癌变的肿瘤患者；④临床病理资料不完整的肿瘤患者。TMA组织芯片记录了患者入院以来的肝功能指标、术后病理报道的肿瘤的大小及卫星灶、出院之后的3年生存率和5年生存率及生存状态等。该研究已通过安徽医科大学附属医院伦理委员会审查(编号：20200863)。

1.2.2苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色 依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、二甲苯Ⅲ 10 min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、90%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min、50%乙醇5 min梯度脱蜡。将石蜡切片放入苏木精染液0.5～1 min，自来水漂洗，1%盐酸乙醇分化数秒，自来水漂洗，然后1%氨水水溶液返蓝1 min，流动水冲洗数秒,放入伊红染液中染色数秒，流动水漂洗。石蜡切片依次放入75%乙醇2 min，85%乙醇2 min，无水乙醇Ⅰ 5 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，二甲苯5 min透明，将切片从二甲苯中取出，中性树脂封片。

1.2.3免疫组织化学染色(immunohistochemistry，IHC) 将组织芯片在60 ℃烘箱中烤片、脱蜡，然后依次将烤好的切片放入二甲苯Ⅰ 6 min，二甲苯Ⅱ 6 min，二甲苯与无水乙醇3 min，无水乙醇6 min，90%乙醇3 min，70%乙醇3 min，50%乙醇3 min，纯水10 min梯度脱蜡；将芯片放入装有枸橼酸钠缓冲液的染色槽内，放入高压锅内，装水，盖上盖子，待上汽上到最大时开始计时20 min,关火放气，取出染色槽，流动水冲洗10 min；将组织芯片浸入30%过氧化氢与甲醇1 ∶9体积混合的混合液中10 min，以过氧化氢酶封闭，用PBS冲洗15 min；破膜液破膜10 min，PBS冲洗15 min；用1%牛血清白蛋白封闭2 h；组织芯片与第一抗体在4 ℃环境下孵育过夜；室温下依次加入反应增强液20 min、辣根酶标记抗兔IgG聚合物30 min，以DAB为显色剂，苏木精复染5 s，最后将切片放入50%乙醇3 min、70%乙醇3 min、90%乙醇3 min、无水乙醇6 min、二甲苯与无水乙醇3 min、二甲苯Ⅰ 6 min、二甲苯Ⅱ 6 min脱水，中性树脂封片。使用Image J软件分析吸光度值。

1.2.4随访 通过与患者或者患者亲属的联系来保持对术后出院患者病情的追踪，可以有效记录术后患者的恢复情况及生存状况。对本标本库中共743位iHCC患者的临床数据进行随访，具有随访信息的为94位。对于术后出院患者最长的随访时间为14年，中位随访时间为48个月。

1.3 统计学处理使用SPSS 25软件对患者的临床特征与目标基因的表达水平进行非参数检验(Kruskal-Wallis，K-W)分析。使用R4.0.5软件对临床数据和吸光度值进行统计分析，组织芯片中各目标基因的表达水平的相关性通过程序包PerformanceAnalytics进行分析。绘制KM(Kaplan-Meier)生存曲线，并通过Cox回归分析计算各影响因素的HR值。通过Nomogram评估各影响因素与HCC患者预后的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳入患者的临床特征在94例HCC患者的肝癌临床信息中，将Phop(T37/46)-4EBP1与患者的临床特征进行统计分析，方差齐性检验提示数据不符合正态分布，因此行非参数检验。因2012年之前未行病理学微血管侵犯检测，因此相关数据未纳入本研究统计分析。见表1。

表1 4EBP1(T37/46)的激活状态与HCC患者临床特征关系分析

2.2 EIF4F复合物的调控基因免疫组化染色及其吸光度值在94例HCC患者的免疫组化染色结果中，EIF4F复合物的调控基因在肿瘤组织中的表达高于其在癌旁组织中的表达(P<0.05)；4EBP1、Phop(T37/46)-4EBP1、EIF4E、Phop(Ser209)-EIF4 E、EIF4G的柱状图提示肿瘤组织中的吸光度值高于其癌旁组织中的(P<0.001或P<0.000 1)。见图1。

图1 肝癌组织及癌旁组织中EIF4F复合物调控基因的表达及吸光度值分析 IHC ×400T：肝癌组织；N：癌旁组织；与癌旁组织比较：***P<0.001，****P<0.000 1

2.3 EIF4F复合物调控基因的蛋白表达量之间的相关性分析在94例HCC患者的肝癌组织中，对EIF4E、EIF4G、Phop(T37/46)-4EBP1的蛋白表达量进行表达的相关性分析，EIF4E与EIF4G的表达量显著相关，相关系数为0.51；Phop(T37/46)-4EBP1与EIF4E、EIF4G的相关系数分别为0.22、0.13。见图2。

图2 EIF4F复合物调控基因的蛋白表达量之间的相关性分析

2.4 Phop(T37/46)-4EBP1与患者生存率的相关性在94例HCC患者的肝癌组织中，Phop(T37/46)-4EBP1表达的生存曲线，Phop(T37/46)-4EBP1高表达组较非高表达组的患者预后生存时间短，差异有统计学意义(P=0.038)。见图3。

图3 HCC患者的生存曲线分析

2.5 Phop(T37/46)-4EBP1的表达与HCC患者临床特征的关系将94例HCC患者的指标纳入多因素回归分析，分析Phop(T37/46)-4EBP1、EIF4E、EIF4G是否过表达，肿瘤数目、肿瘤大小、肿瘤的分化程度、患者的甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平高低对患者预后生存期的影响，在此基础上做出Cox风险比例模型，在以上各种因素与HCC患者预后生存期之间的关系中，肿瘤数目与患者预后之间的相关性最显著(P=0.035)。见图4。

图4 HCC患者的多因素回归分析

2.6 列阵图模型预测HCC患者预后生存时间情况以Cox风险比例模型为基础，对各个危险因素的风险比例分别给予评分，以各患者最终得分总和来预测3年生存率和5年生存率，可以看到Phop(T37/46)-4EBP1与EIF4E的评分是相对较高的，提示其对于HCC患者预后生存时间有着更大的意义。见图5。

图5 HCC纳入患者临床数据回归分析的列阵图模型

3 讨论

4EBP1的磷酸化状态与HCC患者的术后总体生存时间负相关，HCC组织中的4EBP1磷酸化水平增高，与患者预后生存时间显著负相关(图3)。EIF4E与EIF4G的表达是线性相关的；Phop(T37/46)-4EBP1与患者预后3年存活率、5年存活率、肿瘤直径大小、AFP值呈线性相关，可以作为临床重要的评估或参考指标。

Phop(T37/46)-4EBP1是4EBP1的分子功能失活形式。4EBP1是mTOR信号通路的下游中介，mTOR是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[5]，通过磷酸化4EBP1和S6K促进细胞生长和增殖，从而控制蛋白质的翻译过程。在相关性分析中可以看到，EIF4F复合物中的EIF4E和EIF4G之间是线性增加的，而Phop(T37/46)-4EBP1与其之间并没有直接的相关性；单独将Phop(T37/46)-4EBP1与患者预后3年存活率、5年存活率、肿瘤直径大小、AFP等值做Cox风险比例模型回归分析时，得出他们之间具有正相关的关系；列阵图模型分析，由患者年龄、3年生存率、5年生存率、肿瘤直径大小、AFP、EIF4F复合物等值共同评分，预测预后，Phop(T37/46)-4EBP1和EIF4E对于患者预后的评分所占权重较高，提示其对于HCC患者预后生存时间的影响可能较大。

有证据表明，mTOR下游4EBP1、EIF4E水平上的蛋白合成被破坏可以促进肿瘤的形成[6-7]，Phop(T37/46)-4EBP1引导增殖致癌信号，是一个高度相关的恶性潜能分子标记[8]。生长因子受体和细胞信号通路在人类癌症的发生中起着重要的作用，膜生长因子受体的激活通过至少两种主要的生物化学途径，PI3K-AKT-mTOR和RAS-MAPK途径驱动细胞增殖信号[9]。PI3K-AKT通路通过激活mTOR激酶并随后磷酸化其底物4EBP1和S6K来调控翻译。MAPK通路，参与细胞增殖、存活、凋亡和代谢，也有助于4EBP1的磷酸化[10-11]。PI3K-AKT-mTOR和RAS-MAPK通路都介导了4EBP1的磷酸化，导致了Cap依赖的mRNA翻译起始复合物的形成Phop(T37/46)-4EBP1抑制4EBP1的活性并伴随Cap依赖翻译的激活，可促进细胞增殖，并与肿瘤的发生发展有关[12-13]。Phop(T37/46)-4EBP1是4EBP1的灭活形式，作为肿瘤启动子，将上游的致癌信号汇聚并驱动下游的增殖信号，启动细胞周期蛋白D1(Cyclin-D1)、C-MYC或血管内皮生长因子(VEGF)等致癌蛋白的合成。Phop(T37/46)-4EBP1在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌中已被证实与预后密切相关[14]，也有报道[15]指出Phop(T37/46)-4EBP1与许多恶性肿瘤(包括肾细胞癌、黑色素瘤、星形细胞瘤、食道鳞状细胞癌)的侵袭性病理分级与患者的不良预后相关，这对于恶性肿瘤的发生和发展至关重要，Phop(T37/46)-4EBP1在这些肿瘤中的表达都提示了Phop(T37/46)-4EBP1在肿瘤的预后中起到了至关重要的作用。

该研究也有一定的局限性。标本库中的患者失访率较高，最终纳入分析的HCC患者临床数据存在部分缺失。部分指标的数据非正态分布，采用非参数检验。对于EIF4F在HCC发生发展过程中的分子生物学机制，本课题组仍在进一步研究。