促成熟牦牛乳半硬质(切达)干酪成熟特性及挥发性风味物质变化研究

张心予，张兰俊,张玉，陈炼红*

1(西南民族大学 食品科学与技术学院，四川 成都，610041)2(西南大学 食品科学学院，重庆，400700)

牦牛是我国西部青藏高原特有的新型牧畜品种，主要分布地区有西藏、青海和四川等[1]。牦牛乳是营养丰富的优质乳资源，以其为原料制得的半硬质干酪风味浓郁，营养价值高，是一种高原绿色食品[2-3]。

干酪成熟伴随着一系列复杂生化反应的发生，对干酪质地和风味的形成影响重大。蛋白质经酶作用降解，所生成的一些小肽和氨基酸是特定风味物质的前体，或直接形成干酪的风味[4]；乳糖在发酵剂作用下经糖酵解途径产生乳酸；脂肪在脂肪酶作用下水解成脂肪酸、醛类、醇类等一系列化合物[5]。随着干酪成熟时间的延长，干酪的气味和滋味发生改变，KARAMETSI等[6]发现，随着成熟期的延长，苦味肽增加，干酪的苦味增强。程晶晶等[7]研究发现，随着干酪成熟时间的延长，咸味、苦味、坚果味、乳脂味呈增加趋势，涩味、酸奶味、酸味、蒸煮味呈降低趋势。

干酪成熟期通常较长，如半硬质干酪成熟时间为90～180 d，硬质干酪成熟期则长达数年[8-9]。牦牛乳半硬质干酪具有较长成熟期，在实际生产中成本高且难以控制产品品质[4]。国内外学者在研究干酪促成熟时关注点在于仅改变一种成熟条件(温度、压力、发酵剂等)[10]。综合多因素对干酪促成熟工艺进行优化这一方面研究鲜少，且对促成熟后牦牛乳半硬质干酪的成熟特性及挥发性物质变化研究尚为空白。

实验前期对壳聚糖-海藻酸钠固定化酶的制作工艺进行优化[11]，进而选用添加固定化酶、高压处理、改变成熟温度3种因素优化牦牛乳半硬质干酪促成熟工艺，得到最佳工艺条件为壳聚糖-海藻酸钠固定化酶添加量1 200 U/kg，高压1 kPa，成熟温度10 ℃。本试验在此基础上研究促成熟工艺对牦牛乳半硬质干酪成熟特性(质构指标、水分含量、pH、脂肪分解指标、微生物指标)的影响，并采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(solid-phase micro-extraction-GC-MS，SPME-GC-MS)对干酪成熟各阶段风味物质的变化进行探究，进而结合各项指标的变化确定最佳成熟期，在理论及技术上为缩短牦牛乳半硬质干酪成熟期和生产品质把控提供了保证，促进牦牛乳资源的开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛乳，四川省红原县哈拉玛村麦洼牦牛(海拔3 800 m)；R-704菌种、小牛皱胃酶(1 400 U/g)，丹麦Chr.Hansen公司；氯化钙、氯化钠、氢氧化钠、酚酞、乙醇、石油醚、乙醚、氢氧化钾、三氯甲烷、冰乙酸、碘化钾、硫代硫酸钠、营养琼脂、MRS琼脂为分析纯，成都康迪生物有限公司。

LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅，上海市精密仪器仪表公司；SPX-150电热恒温生化培养箱，上海市左乐仪器有限公司；MP512-02精密pH计，德国Matthaus公司；JOYN-SXT-6B 粗脂肪自动测定仪，上海市乔跃仪器有限公司；TMS-PRO食品物性分析仪，美国FTC公司；GCMS-QP2010,日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牦牛乳半硬质干酪促成熟工艺

促成熟牦牛乳半硬质干酪促成熟工艺如下：

原料乳验收→标准化→巴氏杀菌(65 ℃，30 min)→冷却(32 ℃)→发酵剂发酵→壳聚糖-海藻酸钠固定化中性蛋白酶(添加量：1 200 U/kg)→添加0.2 g/L氯化钙→添加0.04 g/L凝乳酶→静置凝乳、切割→升温搅拌→乳清排出→压榨成型→盐渍→真空包装→高压处理(1 kPa)→成熟(10 ℃)

未处理干酪：参考刘兴龙等[12]方法制作，即不添加固定化酶、无高压处理、4 ℃冰箱贮存。

试验以促成熟处理的牦牛乳半硬质干酪作为实验组，未处理干酪为对照组，在成熟的第20、40、60、80天分别对两组干酪进行质构及理化指标的测定，每组干酪平行测定3次。

1.2.2 牦牛乳半硬质干酪成熟期间全质构分析(texture profile analysis，TPA)

参照陈卫等[13]方法测定牦牛乳半硬质干酪硬度、黏性、弹性、凝聚性和咀嚼性。食品物性分析仪测定参数：负载类型Auto-5 g；测试速度1 mm/s；下压距离10 mm；保持时间0 s；探头回复速度1 mm/s；探头P/0.5；样品尺寸(长×宽×高)为5 cm×5 cm×3 cm。

1.2.3 牦牛乳半硬质干酪成熟期间理化指标测定

1.2.3.1 水分含量测定

水分含量测定依据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》。

1.2.3.2 pH测定

参考腾军伟等[14]方法，准确称取10 g研磨过的干酪粉末，加入20 mL蒸馏水，均质2 min后用pH计进行检测。

1.2.3.3 粗脂肪含量的测定

粗脂肪含量测定参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中粗脂肪的测定》。

1.2.3.4 脂肪氧化分解指标的测定

酸价(acid value，ADV)的测定参照GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》；脂肪过氧化值(peroxide value，POV)的测定参照GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》。

1.2.3.5 微生物指标测定

乳酸菌活菌数含量和菌落总数含量的测定分别参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》，GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。

1.2.4 干酪成熟期间挥发性风味物质的变化

采用顶空SPEM-GC-MS技术探究实验组及对照组牦牛乳半硬质干酪成熟期间(20、40、60、80 d)挥发性风味物质的变化。

1.2.4.1 SPME条件

称取5 g样品于20 mL顶空瓶中，将已老化的萃取头插入顶空瓶80 ℃吸附30 min，250 ℃解吸5 min，用于GC-MS分析。

1.2.4.2 GC-MS条件

测定条件参考牛婕等[15]方法，并稍作修改。色谱条件：色谱柱为DB-Wax毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气He流速1 mL/min。色谱升温程序：柱始温度40 ℃维持3 min，以5 ℃/min的速度升到250 ℃，维持3 min。质谱条件：电子电离源(EI)，电子能量70 eV，质量扫描范围40～650 u；全扫描模式。

1.3 数据处理

各试验数据均为3次重复测定，用平均值±标准差表示；使用SPSS 22.0和Microsoft Excel 2016软件进行数据整理分析；采用Origin 2021软件作图。

2 结果与分析

2.1 牦牛乳半硬质干酪成熟过程中TPA的变化

质构指标用于评价干酪成熟过程中口感及品质的变化。由表1可知，随着成熟进行，实验组与对照组牦牛乳半硬质干酪的质构特性有明显差异(P<0.05)。实验组干酪成熟初期由于高压处理时水分被挤压排出，导致硬度远大于对照组。40 d后实验组的硬度明显降低(P<0.05)，是由于在成熟阶段蛋白质和脂肪逐渐分解，产生水分使质地变软。而对照组干酪硬度20 d后无明显变化(P>0.05)，表明成熟速度较为缓慢。干酪成熟40～60 d大分子营养素降解成小分子物质，各组分作用力趋于稳定和平衡，实验组的黏性与弹性相比于对照组呈上升趋势，凝聚性逐渐下降，咀嚼性在40 d后显著下降(P<0.05)，表明促成熟处理加快了蛋白质、脂肪等大分子物质的降解，提高了成熟速度，提升干酪品质。

表1 牦牛乳半硬质干酪不同成熟时间质构特性变化Table 1 Changes in the texture characteristics of yak milk semi-hard cheese at different ripening times

2.2 牦牛乳半硬质干酪成熟期间理化指标的变化

2.2.1 牦牛乳半硬质干酪成熟过程中水分含量的变化

如图1所示，水分含量随时间的增加而减少，40～60 d实验组下降显著(P<0.05)，对照组不显著(P>0.05)。这是由于在干酪成熟过程中随着各种大分子分解为小分子物质时，网络状结构的破坏使结合水流失。促成熟处理(升温、高压)加快了实验组干酪大分子降解速率，在同一时间段内水分减少量大于对照组。

图1 成熟过程中水分含量的变化Fig.1 Changes in moisture content during ripening注：不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.2.2 牦牛乳半硬质干酪成熟过程中pH值的变化

如图2所示，牦牛乳半硬质干酪成熟期间pH值不断升高，0～40 d增长缓慢(P>0.05)，40 d后pH值增长显著(P<0.05)。这是由于乳糖在成熟初期不断分解产生的乳酸中和了蛋白质分解产生的碱性氨基。随着乳糖在成熟中后期的逐渐消耗，乳酸生成减少，干酪pH值呈上升趋势。

图2 成熟过程中pH值的变化Fig.2 Changes in pH value during ripening

2.2.3 牦牛乳半硬质干酪成熟过程中粗脂肪含量的变化

干酪成熟过程中脂肪的降解是形成特征风味的关键反应。由图3可知，随着成熟时间的延长，两组粗脂肪含量均呈下降趋势，实验组下降速率更快。原因在于实验组中加入的外源酶在早期阶段加速了脂肪酶对脂肪的降解，且高压、升温处理加快了生化反应的速度，而对照组由于含水量较低未能充分水解。由此可见，促成熟处理提高了牦牛乳半硬质干酪脂肪分解程度和分解速率，缩短成熟时间。

图3 成熟过程中粗脂肪含量的变化Fig.3 Changes in crude fat content during ripening

2.2.4 牦牛乳半硬质干酪成熟过程中ADV的变化

如图4所示，牦牛乳半硬质干酪ADV随成熟时间的增加不断上升，实验组40 d的ADV与对照组80 d相当。成熟初期部分脂肪酸被乳酸菌生长繁殖所消耗，致使对照组ADV前期增长较平缓。而实验组由于加快了脂肪分解使得变化显著(P<0.05)；成熟后期干酪外壳的形成干扰了游离脂肪酸的扩散，因此实验组ADV后期增长不显著(P>0.05)。

2.2.5 牦牛乳半硬质干酪成熟过程中POV的变化

由图5所示，两组干酪POV变化均为前期慢后期快，且实验组POV高于对照组。由于本试验干酪放置在真空袋中避光贮存，避免了因受到氧气和光照影响导致的POV升高现象。在成熟初期一级氧化产物不断积累生成游离脂肪酸，成熟40 d后逐渐分解为其他挥发性特征风味物质。

图4 成熟过程中ADV的变化Fig.4 Changes in ADV during ripening

图5 成熟过程中POV的变化Fig.5 Changes in POV during ripening

2.2.6 牦牛乳半硬质干酪成熟过程中微生物指标的变化

2.2.6.1 牦牛乳半硬质干酪成熟过程中乳酸菌总数的变化

乳酸菌会将大分子营养物质如碳水化合物、脂肪等降解利用，且自身的增殖发酵作用会产酸，赋予干酪特有的风味。如图6所示，实验组乳酸菌活菌数随天数的延长不断下降，且在40 d后下降显著(P<0.05)。原因在于随着成熟时间延长乳酸菌活性降低，且由上述分析可知，实验组干酪在40 d后水分含量降低、营养物质分解加快，不利于乳酸菌生长繁殖。

图6 成熟过程中乳酸菌总数的变化Fig.6 Changes in the total number of lactic acid bacteria during ripening

2.2.6.2 牦牛乳半硬质干酪成熟过程中菌落总数的变化

如图7所示，两组干酪菌落总数均随着时间的延长不断降低，成熟初期下降显著(P<0.05)，40 d后随着干酪内生化反应的减弱，菌落总数下降缓慢。实验组干酪菌落总数减少量大于对照组，原因是干酪成熟过程的温度始终控制在10 ℃以下，并且进行高压处理降低了水分含量，破坏了有害微生物的生长环境；其次在盐渍阶段盐分会渗入干酪内部，高盐分的环境会有一定程度的抑菌作用。

图7 成熟过程中菌落总数的变化Fig.7 Changes in the total number of colonies during ripening

2.3 促成熟牦牛乳半硬质干酪成熟过程中挥发性风味物质的变化

促成熟工艺处理后的牦牛乳半硬质干酪成熟期间(20、40、60、80 d)挥发性风味物质种类和含量变化结果见表2。

表2 促成熟牦牛乳半硬质干酪成熟过程中产生的 挥发性风味物质 单位：%(相对含量)

续表2

由表2可知，经最佳促成熟工艺处理的牦牛乳半硬质干酪在成熟期间共检测到66种挥发性风味物质，包括酯类29种，酸类17种，酮类9种，醇类5种，烃类4种，其他类物质2种。干酪成熟期间所有检出物中酸类物质相对含量最高，酯类其次，牦牛乳半硬质干酪的风味主要受脂肪代谢形成的酸、醇、酯等挥发性物质的影响，这与王宠等[16]研究结论一致。

2.3.1 酸类挥发性风味物质变化

酸类化合物主要来源于干酪成熟过程中的重要生化反应脂肪水解及乳糖发酵[17]。经促成熟处理牦牛乳半硬质干酪成熟期间产生的酸类物质居各类风味物质首位，相对含量呈先升后降趋势，对牦牛乳半硬质干酪的特征风味形成有较大贡献。成熟40 d酸类物质含量最高82.28%，成熟80 d含量下降至75.41%，表明牦牛乳半硬质干酪整个成熟过程中脂肪的分解不断进行，且速率高于对照组，与前面粗脂肪含量变化一致，促成熟处理效果显著。在整个成熟期间均检测到丁酸、己酸、辛酸、葵酸4种短链脂肪酸，对干酪的特殊风味贡献大[18]。丁酸赋予干酪淡淡的奶油香气，促成熟干酪中丁酸含量超50%，40 d时含量达60.12%，可将其作为特殊的优势风味物质。己酸产生轻微腐臭气味，辛酸使干酪带有微弱的果酸味，经测定二者含量均随成熟时间增加而增加，使长期存放的干酪产生酸败的气味，感官品质下降。因此在把控牦牛乳半硬质干酪品质时要注意减少己酸、辛酸的生成。

2.3.2 酯类挥发性风味物质变化

酯类化合物是重要的香味化合物，大多数酯类给奶酪带来了香甜的水果香气，从而缓解短链酸引起的尖锐感觉，软化整体风味[19]。脂肪酸与醇发生的酯化反应为干酪提供了大量酯类物质。反应产生的甲基或乙基酯是干酪水果风味的主要来源，例如丁酸乙酯有甜果香；癸酸乙酯具有明显的椰子香味[20]。促成熟牦牛干酪在40～60 d酯类相对含量明显增加，其中丁酸丁酯为优势呈香风味物质。随着成熟时间的延长，促成熟处理有利于丁酸丁酯、己酸丁酯、癸酸乙酯等物质的产生，对干酪良好风味的形成起正面作用。

2.3.3 醇类及酮类挥发性风味物质变化

醇类化合物产生的主要途径是乳糖代谢、亚麻酸、亚油酸的降解、氨基酸代谢及甲基酮降解等[7]。因其风味阈值高，对牦牛乳半硬质干酪整体风味影响小。促成熟牦牛乳半硬质干酪中主要的挥发性醇类物质有乙醇、1-丁醇和苯乙醇。成熟60 d实验组与20 d相比1-丁醇含量有所增加，高达9.55%。而成熟至80 d时醇类物质转变为酯类、酮类物质，含量有所下降。

酮类化合物感官阈值低，能赋予干酪浓郁的奶油香味，对干酪的挥发性风味起重要作用[21]。由表2可以发现经过促成熟的干酪酮类物质的相对含量明显增加，成熟期间呈现上升趋势。检测到的酮类挥发性成分以甲基酮类化合物为主，如2-丁酮、2-庚酮、2-壬酮等。此类物质大多伴有令人愉悦的水果清香及奶油味，可适度改善牦牛乳半硬质干酪的感官品质[22]。

2.3.4 烃类及其他类挥发性风味物质变化

烃类化合物及其他类化合物在检出物中相对含量极少。烃类物质芳香阈值较高，风味活性低，对干酪的呈味作用有限。后期产生的微量苯酚可能是由于酪氨酸分解所致，具有防腐和杀菌作用，有利于干酪品质的稳定[23]。

3 结论

牦牛乳半硬质干酪的质构和理化特性受促成熟处理的影响有所变化。随着成熟时间的延长，促成熟干酪的硬度、凝聚性、咀嚼性有所下降，黏性、弹性增加，40～60 d变化更明显；水分含量逐渐降低，pH值升高，脂肪由于微生物的分解数量下降，在酸价以及过氧化值的含量上均高于对照组干酪，说明促成熟后脂肪的分解程度更高、成熟效果更好，成熟40～60 d 营养成分均达较高标准；采用SPME-GC-MS法检测发现，促成熟干酪成熟期间产生的66种风味物质包含酯类、酸类、醇类、酮类、烃类和其他杂环化合物等，其中酯类的数量最多、酸类的相对含量最大，丁酸、丁酸丁酯为牦牛乳半硬质干酪的特征风味物质，且经促成熟的干酪酸类、酮类、醇类物质相对含量显著增加。综合比较促成熟牦牛乳半硬质干酪成熟期间各项指标的大小及变化趋势可知，经促成熟处理的牦牛乳半硬质干酪具有良好的成熟效果，可将半硬质干酪半年成熟期缩短至40～60 d。